Главная страница Случайная лекция Мы поможем в написании ваших работ! Порталы: БиологияВойнаГеографияИнформатикаИскусствоИсторияКультураЛингвистикаМатематикаМедицинаОхрана трудаПолитикаПравоПсихологияРелигияТехникаФизикаФилософияЭкономика Мы поможем в написании ваших работ! |
Культивирование вирусов в культурах клеток
Культура клеток– это клетки многоклеточных организмов (человека, животных), живущие и размножающиеся in vitro. Подразделяются на: Ø первичные (неперевиваемые); Ø полуперевиваемые; Ø перевиваемые. Первичные (неперевиваемые) культуры клеток – клетки, полученные непосредственно из органов и тканей организма (почек, легких, кожи, тимуса, тестикул эмбриона человека или молодых животных). Этапы приготовления первичных культур клеток: Ø выделение органа/ткани; Ø измельчение и гомогенизация ткани до частиц размером 2-4 мм; Ø разъединение клеток путем трипсинизации; Ø внесение в пробирку (флакон, матрас) с питательной средой (среда 199, Игла); Ø инкубирование в термостате – клетки начинают делиться до покрытия поверхности стекла в один слой и прекращают размножаться (контактное торможение). Первичные культуры клеток живут ≈ 7-21 день, при пересевах меняют форму и гибнут. Полуперевиваемые культуры клеток – диплоидные клетки человека, выдерживающие до 50-100 пассажей (после перевивания в новую пробирку со свежей питательной средой вновь начинают размножаться до образования монослоя). Перевиваемые культуры клеток – это клетки, способные к размножению вне организма неопределенно длительное время (злокачественные/опухолевые клетки с гаплоидным набором хромосом, выдерживающие бесконечное количество пассажей): например, HeLa – клетки рака шейки матки (получены от женщины, умершей в 1956 г.), Нep-2 – клетки карциномы гортани и др. Методы индикации вируса в культуре клеток: 1) цитопатическое действие (ЦПД) вируса на клетки – дегенеративные морфологические изменения клеток (мелкозернистое перерождение, округление, фрагментация, образование симпластов); 2) образование вирусом специфических внутриклеточных включений; 3) бляшкообразование (феномен Дальбекко) – образование в монослое клеток «стерильных пятен» (бляшек – деструктивные клетки, разрушенные вирусом и неспособные окрашиваться красителем нейтральным красным (количество бляшек соответствует количеству вирусных частиц); 4) цветная проба Солка – сохранение первоначального цвета среды (красного) при наличии вируса, тогда как активные незараженные вирусом клетки метаболизируют и изменяют цвет среды (желтый); 5) РГА с культуральной жидкостью; 6) реакция гемадсорбции (РГадс) – адсорбция эритроцитов на поверхности пораженной вирусом клетки; 7) феномен интерференции (используется для обнаружения вирусов, не оказывающих ЦПД и не вызывающих гемагглютинацию) – в зараженную материалом культуру клеток вносят индикаторный вирус (ВВС – вирус везикулярного стоматита) с известным ЦПД (симпластобразование) – при наличии в культуре клеток исследуемого вируса индикаторный вирус ЦПД не окажет (клетка может поражаться только одним вирусом). Достоинства – получение максимальной концентрации вируса. Недостатки – не все вирусы культивируются в культуре клеток.
Дата добавления: 2015-06-30; просмотров: 208; Нарушение авторских прав Мы поможем в написании ваших работ! |