Криоэлектронная микроскопия

Иммуноэлектронная микроскопия

Задача - выявление антигенов на субклеточном уровне с помощью меченых электронно-плотными частицами антител (коллоидное золото, ферритин). Трудоемкий и дорогостоящий метод, требующий специальной быстрой фиксации и процедуры обезвоживания и заключения в заливочную среду, которые обычно проводят при пониженной температуре. Заливочные среды – разные, но все – специальные, полимеризация идет не при высокой температуре. Водорастворимые заливочные среды. Все процедуры проводки и заливки направлены на сохранение структуры антигенов. После приготовления ультратонких срезов проводят реакцию с антителами.

Первичные антитела используются разные, не все коммерческие антитела годятся для ИЭМ, не все антитела, «работающие» в ИФА, «работают» в ИЭМ. Вторичные антитела конъюгированы с частицами золота или ферритина, именно они обеспечивают визуализацию антигенов. Для каждого конкретного случая требуется подбор разведений первичных и вторичных антител.

Недостатки метода иммуноэлектронной микроскопии:

- малая толщина срезов лимитирует интенсивность метки;

- слабый контраст – снижение качества изображения, затрудняет идентификацию структур.

Аналог метода замороженных срезов в световой микроскопии – изучение образцов в электронном микроскопе без фиксации и химической обработки. Идея криоэлектронной микроскопии изначально появилась как противопоставление рентгеноструктурному анализу белков – убрать повреждение молекул рентгеновским излучением. В начале 80-х годов проводились исследования по получению витрифицированной формы льда с помощью разных устройств, и в 1982 г. появилась первая статья (Jacques Dubochet с соавт.) с фотографиями аденовируса в слое витрифицированной воды. Затем последовало совершенствование метода, который стал воспроизводимым и доступным при наличии достаточного финансирования для покупки соответствующего оборудования.

Процесс подготовки образцов для криоэлектронной микроскопии должен обеспечивать сохранность нативной структуры макромолекул в водной среде, а сам процесс исследования образцов в микроскопе – устойчивость к воздействию электронного пучка и вакуума.

Образцы для криоэлектронной микроскопии готовят в водной среде (суспензии вирусов, бактерий, мелких клеток, макромолекул), наносят на сеточку и быстро замораживают, обычно в жидком этане, при температуре жидкого азота или близко к ней. Замороженный образец толщиной не более 500 нм помещают в колонну электронного микроскопа, к образцу подводят охлаждение жидким азотом. Получаемые изображения не очень высокого качества.

Другой вариант - приготовление срезов, для чего образец толщиной до десятков мкм либо замораживают в охлажденном до температуры жидкого азота этане, либо в установках замораживания под высоким давлением. Замораживание при высоком давлении позволяет получать образцы до 200 мкм толщиной без кристаллизации льда и без применения криопротектантов. Полученные образцы режут на криоультратоме, срезы помещают на сеточки и изучают в микроскопе.

Срезы для криомикроскопии не контрастируют, соответственно, изображение на экране имеет очень низкий контраст. Для его повышения используют различные технические приспособления, в частности, фильтры, отсекающие электроны с той или иной энергией. Для исследования криосрезов используют электронные микроскопы с ускоряющим напряжением 200 кВ и выше.

Производители предлагают различные устройства для подготовки образцов для криоэлектронной микроскопии, выпускаются электронные микроскопы для изучения структур именно этим методом. Наиболее интересные результаты получают при сочетании криоэлектронной микроскопии с томографией (см. ниже).

Криоэлектронная микроскопия в целом является мощным инструментом изучения нативной структуры мелких биологических объектов.

Дата добавления: 2014-03-03; просмотров: 1262; Нарушение авторских прав

Мы поможем в написании ваших работ!