АППАРАТ ГОЛЬДЖИ

Клатрин-зависимый эндоцитоз и клатрин-опосредованный транспорт внутри клеток изучаются давно. Клатрин-опосредованный транспорт обеспечивает сортировку и доставку молекул между мембранными компартментами клетки: от аппарата Гольджи клатриновые пузырьки переносят кислые гидролазы в ранние эндосомы, которые с этого момента становятся поздними эндосомами, «клатриновые» пузырьки обеспечивают перенос мембранных фрагментов между разными типами эндосом.

Могут ли «опушенные» пузырьки переносить в клетку только один лиганд, или несколько одновременно? Такая ситуация может быть при стимуляции клетки двумя гормонами. Применение методов цитохимии с использованием разных меток показало, что в одном пузырьке могут интернализоваться разные лиганды.

Клетка – сложная система специализированных взаимодействующих компартментов, в которой действуют многочисленные правила и запреты, регулирующие ее жизнедеятельность. Важное место в жизнедеятельности клетки занимает транспорт макромолекул. Представления о транспорте макромолекул сильно изменились за последние 20 лет. В настоящее время известно несколько вариантов переноса макромолекул, опосредованных мембранными структурами:

- формирование трубочек, которые «вырастают» до целевой мембраны, такой транспорт составляет до 20% всего транспорта;

- “Kiss-and-run” – пузырек-переносчик вступает в кратковременный контакт с целевой мембраной;

- пузырек-переносчик сливается с целевой мембраной.

Наиболее изученным является транспорт макромолекул посредством «опушенных» пузырьков, которые так называют, потому что в электронном микроскопе на поверхности этих пузырьков находится зубчатый слой электронно-плотного вещества. Существует три вида таких пузырьков:

1. Сlathrin-coated vesicles (пузырьки с «опушением» из клатрина):

А. формируются на плазмалемме

Б. формируются на мембранах транс-сети АГ и переносят

молекулы в лизосомы

В. Формируются из мембраны эндосом и переносят молекулы между разными типами эндосом.

2 и 3. Non-clathrin-coated vesicles (COP-coated vesicles) – пузырьки «без клатрина»:

2. COP-I

3. COP-II

COP - coat protein complex.

COP-I комплекс образован 7 белками COP, которые накапливаются в цитоплазме, затем соединятся с мембраной и локализуются снаружи сформировавшегося пузырька. Главной функцией COP-I является ретроградный транспорт белков из зоны промежуточного ЭПР и цистерн АГ обратно в ЭПР.

Комплекс COP-II образован 5 белками COP, и обеспечивает перенос синтезированных в ЭПР белков в АГ.

Перенос макромолекул осуществляется с помощью мелких пузырьков, которые отшнуровываются от одной мембраны и сливаются с другой. Таким образом формируются транспортные потоки в клетке, переносящие макромолекулы от одного органоида к другому. Мембранный транспорт регулируется многочисленными факторами, включая белки связывания SNARE (soluble Nethylmaleimide-sensitive factor attachment protein receptor), ГТФ-связывающие белки и факторы «привязывания» пузырьков. Последние обычно являются длинными суперспиральными белами, или сложными многокомпонентными белковыми комплексами, и обеспечивают физическое связывание пузырька с мембраной целевого органоида. Белки SNARE пузырька и целевой поверхности переплетаются друг с другом, обеспечивая слияние фосфо-оипидных бислоев мембран.

Существуют 4 стадии, обязательные для всех видов транспорта с помощью «опушенных» везикул:

1. Почкование: белки «опушения» связываются с мембраной-донором и индуцируют формирование пузырька. С этими белками связываются SNARE и переносимые молекулы. Пузырек отпочковывается от мембраны.

2. Перемещение пузырька к целевой мембране (путем диффузии или при участии цитоскелета).

3. «Причаливание» пузырька к целевой мембране, обеспечивается специальными факторами «привязывания» (tethering factors).

4. Слияние пузырька с целевой мембраной: SNARE пузырька и SNARE целевой мембраны взаимодействуют, образуя четырехспиральную ленту (trans-SNARE комплекс), которая опосредует слияние мембран и доставку переносимой молекулы.

Важным элементом транспорта макромолекул в клетке является перенос синтезированных белков из ЭПР. На мембранах ЭПР синтезируется около одной трети всех белков клетки, которые нужно доставить «по месту назначения», за что отвечают белки мембраны ЭПР. Синтезированные липиды и белки находятся в просвете и в мембранах ЭПР, откуда они должны попадать в другие части клетки. Для этого существует достаточно сложная система транспорта макромолекул.

Сигналом к началу транспортного процесса является накопление белка в просвете ЭПР. Основное направление транспорта - от мембран ЭПР в АГ, затем – между цистернами АГ, затем – в лизосомы и плазматическую мембрану. Особенностью макромолекулярного транспорта является сортировка макромолекул, - очень важный момент транспорта, осуществляется на каждом его этапе. Так, часть синтезированных белков остается в ЭПР. В первую очередь, это – белки, связанные с функциями ЭПР, с синтезом и процессингом белков. Т.о., происходит первая сортировка белков – одни направляются в АГ, другие – остаются в ЭПР. Происходит разветвление транспортного потока. Аналогичное разветвление имеет место на каждой последующей стадии транспорта макромолекул.

Формирование транспортных везикул и трубочек на поверхности ЭПР происходит в строго определенных участках мембраны ЭПР, лишенных рибосом – в т.н. переходном, или промежуточном ЭПР (transitional ER). В клетках млекопитающих эти участки экспорта находятся вблизи цис-стороны аппарата Гольджи, и часто идентифицируются как «промежуточный компартмент между ЭПР и аппаратом Гольджи», используется также название «везикуло-тубулярные кластеры» (vesicular tubular clusters).В этой области в мембранах ЭПР обнаруживается большое количество молекул COPII и COPI, в электронном микроскопе в области переходного ЭПР наблюдаются везикулы и трубочки. Нужно отметить, что транспорт может быть и не связан с COPI и COPII, а происходить при участии других механизмов.

Комплекс COPII деформирует мембрану, которая формирует пузырек. Точный механизм неизвестен, но есть данные о существовании «скелетных» молекул. COPII опосредует отбор переносимых из просвета ЭПР молекул прямым образом (основная масса трансмембранных белков), или непрямым, через специфические транспортные рецепторы (в случае переноса растворимых молекул и некоторых трансмембранных).

Интересным и непонятным является механизм формирования COPII везикул разных размеров, - они переносят молекулы разной величины – от небольших рецепторных до крупных секретируемых, таких как проколлаген.

Пузырек, отшнуровавшись, либо переносится к целевой мембране, теряет «опушку», затем сливается с мембраной, либо вместе с другими структурами формирует т.н. «тубуло-ретикулярные кластеры», которые, полагают, являются составной частью АГ.

Общей закономерностью мембранного транспорта является неизменная локализация молекул – если молекула находится с внутренней стороны мембраны, она там и остается на протяжении всей транспортировки и встраивается при слиянии везикулы тоже с внутренней стороны. Сигналом для направления белка дальше или его локализации на месте являются специальные аминокислотные последовательности. Сигнальные последовательности, определяющие локализацию того или иного белка в клетке, являются своеобразным «штампом о прописке» белка в той или иной клеточной структуре. Например, о локализации в ЭПР сигнализирует последовательность лизин-аспарагин-глутамин-лейцин на С-конце пептидной цепи. Интересно, что эта и аналогичные последовательности не препятствуют растворимым белкам перемещаться внутри пузырьков в АГ, если белки случайно захватываются с содержимым формирующихся пузырьков. Это – своеобразный транспорт «навалом», когда захватывается все подряд, как при погрузке грунта экскаватором. Это – так называемый bulk transport. Его особенность – неспецифический захват, в пузырек попадает все подряд.

Нужно отметить, что попавшие не по назначению белки ЭПР, возвращаются обратно - наличие сигналов об ЭПР-принадлежности служит сигналом к их возвращению из АГ с потоком обратного транспорта.

Считалось, что COPII индуцирует почкование пузырьков на мембране ЭПР, которые отшнуровываются, затем теряют «опушение» и сливаются с мембранами АГ или между собой, и формируют тубуло-везикулярные кластеры. Более поздние исследования показали, что имеется формирование не только пузырьков-COPII, но и тубулярных выростов. Пузырьки COPII имеют размеры 60–90 nm, что недостаточно для транспортировки крупных молекул белка, например, проколлагена. Видимо, это делают трубочки. Было показано выпячивание мембраны ЭПР и формирование тубулярных структур вне зон локализации COPII, но рядом с ними. Нужно изучать дальше.

COPI считается ответственным за формирование опушенных пузырьков, переносящих белки ЭПР обратно из более поздних компартментов. Наблюдали формирование COPI-везикул на мембранах АГ и тубуло-везикулярных комплексов.

Соотношение COPI и COPII важно для сбалансированного транспорта.

АППАРАТ ГОЛЬДЖИ

Аппарат Гольджи известен более 100 лет. Сначала про него просто знали. Потом изучали в ЭМ, возникли модели функционирования и строения. Сейчас изучаются молекулярные механизмы его функционирования, взаимосвязи с другими структурами.

В PubMed ежегодно фиксируется более 700 статей, посвященных аппарату Гольджи.

В световом микроскопе АГ можно увидеть как мелкую зернистость или сеточку при применении специальных методов окраски. Изучение ультратонких срезов показало, что АГ состоит из уплощенных цистерн и связанных с ними трубочек и пузырьков. Цистерны иногда называют диктиосомами. Комплекс Гольджи (лента Гольджи, Golgi ribbon) образован отдельными аппаратами Гольджи, которые соединяются тубуло-везикулярными областями. Зону цистерн называют «компактной зоной», а тубуло-везикулярные области – «некомпактными зонами».

В последние годы показана необходимость структур цитоскелета для поддержания морфологии и функций АГ. В клетке АГ располагается рядом с центром организации микротрубочек (МОЦ). При повреждении микротрубочек АГ распадается на мелкие цистерны (министопки). Интересно, что они через некоторое время способны нормально гликозилировать белки.

Комплекс Гольджи является самоорганизующейся структурой, это было доказано в опытах по изучению воздействия микроинъекций брефелдина. При введении препарата комплекс буквально «рассыпался» в течение минут, при этом многие его мембранные компоненты адсорбировались на мембранах ЭПР. После отмывки препарата структура комплекса Гольджи полностью восстанавливалась, и он работал совершенно нормально. В этом процессе задействованы ГТФ и Arf1.

Аппарат Гольджи имеет сложную структуру и, тем более интересно, что во время митоза он распадается, после митоза – собирается, и так на протяжении каждого клеточного цикла. Сейчас уже установлены некоторые молекулярные механизмы этого процесса. В том числе показана важная роль убиквитина (ubiquitin).

Недавно было показано, что АГ способен воспринимать сигналы стресса и инициировать апоптоз в клетке.

АГ, или КГ, работает как фабрика, обеспечивающая процессинг и сортировку огромного количества белков, синтезированных в ЭПР. АГ завершает формирование функционально полноценных белков и направляет их к месту локализации – в лизосомы, плазмалемму или на упаковку и секрецию. АГ действует и как производитель, и как транспортный узел, и как диспетчерский пункт. Именно в этой структуре сосредоточено управление потоком синтезированных макромолекул, АГ – центральная «сортировочная станция» клетки.

Работа АГ точно сбалансирована, мембранные потоки, приходящие и выходящие, должны соответствовать друг другу, иначе структура не будет стабильной.

В АГ образуются гликопротеины, гликолипиды и сфингомиелин.

Главной и удивительной особенностью АГ является его структурная и функциональная полярность. Белки поступают из ЭПР с цис-стороны, которая обычно выпуклая и обращена к ядру. Затем белки переносятся через цистерны и попадают на вогнутую транс-сторону. В процессе перемещения в мембранах АГ белки модифицируются и сортируются.

Транс-сторона служит местом выхода белков, завершивших свое формирование и готовых к работе по месту назначения в клетке.

Процессинг и сортировка белков в АГ очень четко разграничены, что предполагает существование дискретных компартментов в АГ. Точное число этих компартментов не установлено, и поэтому принята простейшая модель структуры АГ, предполагающая три функциональных отдела: цис-сеть АГ, стопки АГ, и транс-сеть АГ.

Цис-сеть АГ в первую очередь предназначена для приема транспортных везикул и их сортировки. Белки, имеющие «метку» ЭПР, распознаются, упаковываются в везикулы и отправляются назад. Остальные белки переправляются транспортными везикулами в центр стопки АГ, где находится центр метаболической активности АГ. Здесь происходит модификация молекул, и отсюда белки, липиды и углеводы переправляются в транс-сеть АГ для дальнейшей упаковки и доставки к месту назначения.

В АГ происходит гликозилирование белков. Первичное присоединение углеводной цепи к N-концу пептидной цепи происходит в ЭПР, а в АГ идет модификация этой цепи, добавление одних и удаление других остатков. Показано, что по мере продвижения от цис- к транс- стороне происходит изменение набора ферментов, имеет место тонкая субкомпартментализация мембран АГ. Молекулярные механизмы этого процесса до конца не установлены.

Важным является вопрос о механизмах транспорта между цистернами АГ. Предполагают 3 возможных механизма:

1. мембраны цистерн «созревают» и перемещаются вместе с материалом внутри их просвета по АГ, - механизм формирования секреторных гранул.

2. пузырьки переносят материал между цистернами.

3. трубочки соединяют цистерны.

Современным данным более соответствует механизм 1, однако есть много данных и об участии механизмов 2 и 3. Скорее всего, имеют место все три механизма.

В разных клетках в стопках АГ присутствуют разные ферменты, обеспечивающие модификацию углеводных остатков, поэтому в целом получается колоссальное количество вариантов гликопротеинов.

Для белков, предназначенных для транспорта в лизосомы, существует единое звено модификации – фосфорилирование маннозы, благодаря которому происходит отбор этих белков и направление именно в лизосомы.

Дата добавления: 2014-04-24; просмотров: 966; Нарушение авторских прав

Мы поможем в написании ваших работ!