Понятие о молекулярных методах ДНК-диагностики моногенных заболеваний

В основе анализа ДНК лежат две её особенности как носителя генетической информации:

-последовательность нуклеотидов, индивидуальная для каждого отдельного человека, кроме однояйцевых близнецов;

-одинаковая структура ДНК во всех соматических клетках у человека.

ДНК может быть выделена из любого типа тканей или клеток организма, содержащих ядра. Чаще всего используют для получения образцов ДНК лейкоциты периферической крови и клетки ворсин хориона.

Методы диагностики ДНК включают направление по определению специфических нуклеотидных последовательностей – генное зондирование,или гибридизационный анализ, и метод полимеразной цепной реакции.

В первом случае осуществляется регистрация последовательностей небольшой длины, до 30 пар нуклеотидов, с помощью зондов – участков ДНК, синтезированных с радиоактивным мечением. Такие зонды гибридизовались с изучаемыми образцами ДНК (по Саузерну). Зонд специфически соединиться либо с нормальным, либо с мутантным геном (комплиментарные связи) и патология выявится путём обнаружения радиоактивных импульсов. В настоящее время этот метод проводится для диагностики талассемий, фенилкетонурии, недостаточности альфа-антитрипсина.

Второй метод, имитирующий естественную репликацию ДНК, позволяет обнаружить и многократно копировать определённый фрагмент ДНК, который в дальнейшем подвергается электрофорезу и анализу.

Прежде чем проводить ПЦР, необходимо узнать нуклеотидную последовательность искомой НК. После этого синтезируются два коротких ДНК-зонда или праймера, которые комплементарны соответствующим участками НК-мишени. Праймер – самый главный элемент в ПЦР, обеспечивающий запуск и специфичность реакции. Таким образом, тест-система для ПЦР состоит из смеси НК испытуемого образца, праймера, дезоксирубонуклеотидов (набора нуклеотидтрифосфатов) и термостабильной ДНК полимеразы (энзима термофильных бактерий Termusaquaticus). Вышеуказанную реакционную смесь подвергают повторным циклам нагревания/охлаждения для денатурации (при нагревании) НК и гибридизации или отжиге (при охлаждении) праймеров с целью синтеза (с помощью ДНК-полимеразы) новых НК.

Ход ПЦР схематично представляет три основных этапа собственно амплификации: денатурации, отжига и синтеза (удлинения) НК. Сама полимеразная реакция проходит автоматически в программируемом термостате – термоциклере (амплификаторе), который может нагревать и охлаждать пробирки с реакционной смесью в очень короткое время. Трехступенчатый цикл, в результате которого получаются точные копии идентифицируемого участка матричной НК, повторяется 30-50 раз в соответствии с заданной программой термоциклера.В первом цикле происходит первое удвоение фрагмента нити НК, ограниченного праймерами, в последующем реакция приобретает каскадный характер (цепная реакция). Это означает, что каждая из нитей служит матрицей для синтеза (полимеризации) нового участка НК, что позволяет увеличивать число копий амплифицируемого фрагмента НК в геометрической прогрессии. Течение ПЦР аналогично естественной репликации НК, но при этом строго фиксированно искусственно синтезированным праймером.

Так, если один цикл продолжается примерно 3 минуты, то менее чем через 2 часа можно получить около миллиарда копий определяемой последовательности НК. Если в растворе не окажется ни одной молекулы НК с участком, комплементарным внесенным праймерам, даже, несмотря на то, что в растворе будет плавать миллион других молекул НК, реакция ПЦР не пройдет. После 25-30 циклов экспоненциального нарастания продуктов реакции происходит выход на плато из-за истощения трифосфатов, праймеров и повреждений полимеразы. Поскольку праймеры физически включаются в концы ампликонов, этим самым детерминируется продукт ПЦР – фрагмент НК. Кроме того, ДНК-полимераза обладает способностью выбраковывать (редактировать) ошибочные некомплементарные нуклеотиды. Этим достигается высокая специфичность результатов исследования.

Продукты ПЦР, или ампликоны, представляющие собой участок синтетической НК, ограниченный праймерами, на конечной стадии ПЦР идентифицируют методом элетрофореза в геле.

Если учесть продолжительность процедуры выращивания культуры клеток (от нескольких недель до нескольких месяцев), то преимущество метода ПЦР становится несомненным. Результаты ПЦР-анализа можно получить в течение одного рабочего дня, при этом отобранные для анализа пробы могут храниться (накапливаться) в течение даже нескольких недель при соблюдении соответствующих температурных норм. Проведенная недавно в нескольких зарубежных исследовательских центрах суммированная оценка чувствительности различных методов диагностики показала, что «быстрые»или экспресс-тесты имеют чувствительность 40-60%, ИФА - 50-70%, прямая иммунофлюоресценция (ПИФ) - 55-75%, культуральное исследование - 60-80%, а ПЦР от 90 до 100%. Как видно ПЦР, по сравнению с другими способами обладает двумя важными преимуществами: высокой чувствительностью и непродолжительностью по времени анализа, т.е. «актуальностью» получения результата исследования врачом и пациентом.

ПЦР (полимеразная цепная реакция) используется в дородовой диагностике, когда по материалу ворсин хориона или других клеток плода, в течении двух дней можно дать ответ о наличии или отсутствии у будущего ребёнка мутантного аллеля. На ранних сроках беременности это позволяет врачам принять решение о ведении беременности, коррекции дефекта, подготовки семьи к ожидаемому событию.

С помощью методов ДНК-диагностики можно маркировать как нормальный, так и «патологический» ген, определять его наличие у членов семьи, выявлять в гомо- или гетерозиготном состоянии.

Кроме того, ДНК-технологии находят применение в исследованиях для определения происхождения популяций людей, в практике судебной медицины, для определения отцовства или степени родства, для генетического анализа клеток костного мозга при его трансплантации от донора реципиенту, для расшифровки генома человека.

Основные выводы темы

1. Нуклеиновые кислоты – материальные носители наследственной информации, они контролируют все процессы жизнедеятельности клеток, их физиологическую активность.

2. Биосинтез белка в клетке является результатом реализации генетической информации.

3. Главными свойствами генов является способность рекомбинироваться и мутировать.

4. Возможность менять структуру генов лежит в основе генной инженерии и биотехнологии.

5. Биосинтетические реакции отличаются видовой и индивидуальной специфичностью и как все процессы метаболизма в клетке протекают под контролем наследственного аппарата.

Вопросы для самоконтроля

1. Что является мономером нуклеиновых кислот? Из каких частей состоит этот мономер?

2. Сколько типов нуклеотидов входит в состав ДНК и РНК?

3. Что такое генетический код? Основные свойства генетического кода?

4. Почему биосинтез белка происходит в цитоплазме, а не в ядре, где находится матричная ДНК?

5. Почему молекула ДНК не транспортируется из ядра в цитоплазму, к месту синтеза белка? Ведь в этом случае не нужна была бы молекула-посредник – информационная РНК?

6. Существует большое разнообразие видов белков. Объясните причины этого разнообразия. Примеры?

7. По одной молекуле и-РНК движется друг за другом несколько рибосом. Одинаковый ли аминокислотный состав и последовательность будут иметь синтезируемые на них белковые молекулы? Почему?

8. Одинаковые или разные по аминокислотному составу и последовательности белковые молекулы будет синтезировать одна и та же рибосома на разных и-РНК? Почему?

9. Обнаружение биохимических дефектов генов. ДНК-диагностика моногенных заболеваний.

Дата добавления: 2014-11-24; просмотров: 319; Нарушение авторских прав

Мы поможем в написании ваших работ!