Лекция № 8

Тема:

«Вирусы. Морфология и физиология вирусов.

РНК- и ДНК-содержащие вирусы. ВИЧ и СПИД».

Вопросы:

Морфология вирусов. Особенности репродукции вирусов. Профилактика вирусных заболеваний, особенности терапии. Основные методы диагностики вирусных инфекций.

РНК-содержащие вирусы. Вирусы гриппа. Эпидемиология и патогенез гриппа. Иммунитет. Специфическая профилактика.

ДНК-содержащие вирусы. Вирусы гепатитов. Эпидемиология и патогенез. Иммунитет. Специфическая профилактика.

ВИЧ. СПИД. Актуальность вопроса. Эпидемиология и патогенез заболевания. Профилактика.

ЛАБОРАТОРНАЯ ДИАГНОСТИКА ВИРУСНЫХ ИНФЕКЦИЙ ЧЕЛОВЕКА И ЖИВОТНЫХ

Лабораторная диагностика вирусных инфекций чело­века и животных основана: 1) на прямых микроскопичес­ких методах обнаружения вирионов в патологических материалах; 2) серотипаже (идентификации) чистых культур вирусов, выделенных из них; 3) серодиагности­ке, т. е. косвенном способе определения вирусспецифичес-ких антител в сыворотке крови. При этом: материалы ис­следуются в иммерсионном, люминесцентном и электрон­ном микроскопах; культуры вирусов получают, инфици­руя материалами чувствительные к ним линии клеток, куриные эмбрионы и животных; идентификацию вирусов и определение вирусспецифических антител осуществля­ют в серологических реакциях.

Патологические материалы и их обработка. Матери­алами, в которых содержатся вирусы, могут являться: кал, моча, мокрота, носоглоточные смывы, содержимое высыпаний на коже и слизистых оболочках и прочие экскреты; кровь, спинномозговая жидкость, пунктаты плевральной и брюшной полости, суставов, увеличенных лимфатических узлов и другие секреты. От умерших лю­дей и погибших животных берут пораженные вирусами органы и ткани. Здесь нужно отметить, что взятые для исследования материалы при необходимости подвергаются специальной обработке для приготовления мазков и гис­тологических препаратов, а при инфицировании культур клеток, эмбрионов и животных - измельчаются, отстаива­ются, фильтруются, осветляются, концентрируются и обрабатываются антибиотиками, которые уничтожают пос­тороннюю (банальную) микрофлору, в большом количест­ве находящуюся в экскретах.

Микроскопические способы обнаружения вирусов

Рис. 10 9. Схематическое изображение

вирусных включений: 1 - тельца Гуарниери в клетке, зараженной вирусом оспы; 2 - включения в цилиндри­ческом эпителии, зараженном вирусом гриппа; 3 — включения в эпителии, зара­женном реовирусом; 4 — тельца Бабеша — Негри в нейроцитах; 5,6- внутриядерные включения в эпителии, зараженном герпес-и аденовирусом; 7 - внутриядерные и цитоплазматические включения в эпителии, зараженном вирусом кори

Используются два микроскопических способа выявления вирусов в материалах - вирусоскопия в иммерсионном и лю­минесцентном микроскопах и электронная микроскопия.

Вирусоскопия. В иммерсионном световом микроскопе обнаруживаются самые крупные элементарные тельца. Так, при натуральной оспе в жидкости кожных пузырь­ков находят внеклеточные вирионы Пашена, а в таких же везикулах при ветряной оспе - вирионы Арагао.

Легче при вирусных инфекциях обнаружить внутри­клеточные включения. В большинстве своем они представ­лены скоплениями вирусов вперемежку с реактивными клеточными продуктами и в зависимости от места репликации вирионов находятся в цитоплазме или ядре клеток-хозяев. В частности, цитоплазматическими включениями являются тельца Гуарниери в эпителиальных клетках, скопления реовирусов и вирусов гриппа в них, тельца Ба­беша - Негри - в нейроцитах, а ядерными включениями -адено-, папова- и герпесвирусные, правда, состоящие из клеточного материала. Изредка в одной и той же клетке вирусы, например коревой, формируют цитоплазматические и ядерные включения (рис. 109).

По форме, размерам, структуре, отношению к краси­телям все эти и другие вирусные включения строго спе­цифичны. Например, тельца Гуарниери имеют округлую, серповидную или амебоидную форму с диаметром 1-10 мкм, тельца Бабеша - Негри - овальные или эллипсоидные, достигающие 20 мкм, включения реовирусов - серпо­видные, наполовину охватывающие клеточное ядро, коревые включения - в виде почкующихся мелких дрожжей.

При этом для обнаружения телец Пашена и Арагао мазки подвергают «серебрению» по методу Морозова или обрабатывают вируснейтрализующими антителами, ме­ченными флюорохромами.

Проводя «серебрение», заранее готовят три раствора: № 1 - уксус-но-формалиновый фиксатор (100 мл дистиллированной воды + 1 мл ледяной уксусной кислоты + 2 мл 40 % -ного формалина); № 2 - та­нин-феноловая протрава (10 мл той же воды + 5 г танина + 1 мл жидкого фенола); № 3 - адсорбент (свежеприготовленный 5 % -ный раст­вор нитрата серебра с добавлением нескольких капель аммиака, вы­зывающего легкую опалесценцию). «Серебрение» мазков выполняет­ся в три этапа с промыванием после каждого из них водопроводной во­дой: мазки фиксируются раствором № 1 в течение 1 мин; протравлива­ются раствором № 2 с подогревом до отхождения паров; «серебрятся» раствором № 3 с подогревом до появления темно-коричневого цвета.

В высушенных мазках под иммерсионным микроско­пом обнаруживают грозди кокковидных вирионов корич­нево-черного цвета.

В препаратах, обработанных мечеными антителами (см. «Реакцию иммунофлюоресценции»), при люминесцент­ной микроскопии обнаруживают вне- и внутриклеточно расположенные вирионы в виде светящихся точек и конг­ломератов.

Внутриклеточные вирусные включения окрашивают по Туревичу, Муромцеву и Романовскому — Гимзе.

Способ окраски телец Бабеша - Негри и Гуарниери по Туревичу. Пре­параты из срезов гиппокампа при бешенстве или роговицы зараженного кролика при оспе в течение 2 мин окрашивают вначале железным гема­токсилином, вслед за чем промывают водой. Докрашивают 1 % -ным вод­ным раствором кислого фуксина 1 мин и снова промывают водой. На последнем этапе препараты обрабатывают смесью из равных частей на­сыщенного водного раствора пикриновой кислоты и 95 % -ного спирта, быстро промывают, высушивают и на несколько секунд погружают в аб­солютный спирт, вновь высушивают и микроскопируют.

Способ окраски телец Бабеша - Негри по Муромцеву. Из растер­тых в ступке кусочков гиппокампа делают обычные мазки. Фикси­руют их метиловым спиртом или ацетоном в течение 1-2 ч, промы­вают водой; затем 5-10 мин окрашивают разведенным 1 : 50 красителем Мансона (2 г метиленового синего, 5 г буры и 100 мл дистил­лированной воды), после чего переносят в 10 %-ный раствор танина до получения бледно-голубой окраски, промывают водой, высуши­вают; несколько секунд обрабатывают абсолютным спиртом, высу­шивают и микроскопируют.

Окраска мазков по Романовскому - Гимзе осуществляется смесью азур-эозин-метиленового синего после их фиксации в метиловом (5 мин), этиловом (10-15 мин) спиртах или в смеси Никифорова (10-15 мин). Окрашивание длится от 20-30 мин до 1 ч.

Тельца Бабеша - Негри по Туревичу окрашиваются в вишнево-красный цвет с черными зернами внутри, а цито­плазма нервных клеток, в которых они находятся - в свет­ло-желтый; по Муромцеву - в бледно-фиолетовый, а цито­плазма клеток - в синий. Тельца Гуарниери, окрашенные по Туревичу, приобретают темно-синий цвет и тоже хорошо контрастируют в более светлой цитоплазме эпителия.

По Романовскому - Гимзе ядра клеток окрашиваются в пурпурно-красный цвет, цитоплазма - в синий, а вирус­ные включения - в разные цвета и оттенки: тельца Бабе­ша - Негри, в частности, - в красный, включения вируса гриппа - в сине-фиолетовый, тельца Гуарниери - в пур­пурно-красный, а реовирусов - в фиолетовый.

Электронная микроскопия. В электронном микроскопе вирусы идентифицируют по тонким деталям их ультра­структуры. С этой целью получают микрофотографии. Для этого материал, содержащий вирусы, наносят на электрон­но-микроскопические сеточки, покрытые перлодиевой пленкой, и вирионы контрастируют 1 %-ным уранилацетатом или фосфорно-вольфрамовым натрием. Покрывая вирусы, эти вещества создают вокруг них темный фон, а проникая вглубь между компонентами вирионов, способ­ствуют выявлению деталей их структуры. Наконец, кон­фигурация вирионов отчетливо отпечатывается на матри­цах-репликах высохших пленок пластмассы, раствором которых они заливаются. Симметрию и распределение белковых субъединиц в блоке-ансамбле вирусных крис­таллов изучают с помощью рентгеноструктурного анализа.

Выделение вирусов из биологических материалов

Чаще всего вирусы выделяют из патологических мате­риалов в культурах клеток и куриных эмбрионах, реже их культивируют в организме экспериментальных животных.

Выделение вирусов в культурах клеток. В большин­стве случаев вирусы человека и животных выделяют на

Рис. 110 Культура клеток:

а-нормальный рост; б-ЦПД вируса

первичных культурах почек эмбрионов человека и обезьян или же на перевиваемых культурах клеток HeLa, Нер-2, KB, Vero, FL. При этом исследуемым материалом заража­ют лишь те из них, в которых под малым увеличением микроскопа наблюдается хороший рост клеток. Отсосав питательную среду, в каждую пробирку или флакон вно­сят по 0,1-0,2 мл материала, предварительно обработан­ного антибиотиками. После 30-60-минутного контакта материала с клетками его удаляют, покрывают свежей пи­тательной средой и помещают в ультратермостат.

О размножении вирусов в монослое судят по цитопатическому действию (рис. 110), выражающемуся в округле­нии и сморщивании клеток (пикорнавирусы), нарастаю­щей деструкции пласта (герпесвирусы), нередко с перво­начальной пролиферацией клеток (поксвирусы). Пикор­навирусы, герпесвирусы, многие тогавирусы, буньявиру-сы, разрушая монослой, образуют под агаровым покрыти­ем бляшки («стерильные пятна»), каждая из которых представляет собой обособленную колонию вируса. При размножении некоторых вирусов образуются многоядер­ные клетки (парамиксовирусы, герпесвирусы). Целый ряд вирусов в цитоплазме и ядре формируют внутрикле­точные включения округлой формы. Онкогенные вирусы вызывают трансформацию нормальных клеток в злокаче­ственные, чему нередко предшествуют хромосомные из­менения в ядрах монослоя. Пораженные инфекционными вирусами клетки обычно содержат огромное количество незрелых вирионов и их антигенов, которые выявляют с помощью флюоресцирующих антител. Если вирусы имеют большие размеры и, размножившись, отпочковывают­ся от клеток, то в содержимом клеточного пласта под им­мерсионным микроскопом, как уже отмечалось, удается обнаружить зрелые вирусные частицы.

Размножение вирусов, не обладающих цитопатическим действием (ЦПД), можно установить с помощью реакции гемадсорбции, проявляющейся скучиванием добавленных эритроцитов на инфицированных клетках (рис. 111) вслед­ствие наличия у многих вирусов гемагглютининов (миксовирусы, тогавирусы). Гемагглютинацию можно увидеть и невооруженным глазом на предметном стекле, прибавив к капле культуральной жидкости соответствующие эрит­роциты (рис. 112). Например, миксовирусы гемагглюти-нируют эритроциты 0 группы человека, а 60 % тогавирусов - эритроциты гусей. Ряд вирусов можно выявить по феномену интерференции, т. е. способности подавлять ЦПД другого вируса (вирусы лейкоза птиц интерфериру­ют с вирусом саркомы Рауса). При этом, правда, надо иск­лючить явление аутоинтерференции.

Выделение вирусов в курином эмбрионе. Для выделения вирусов из материалов используются, главным образом, 7-11-дневные эмбрионы белых кур. Заражение произво­дят на хорионаллантоисную оболочку (ХАО), в аллантоисную и амниотическую полости, желточный мешок и тело зародыша (рис. 113). При этом выбор пути инфицирования определяется специфическими свой­ствами вирусов.

Перед заражением яйцо поме­щают в овоскоп и, установив жиз­неспособность эмбриона и грани­цы воздушного мешка, спиртом и йодом обрабатывают над ним скорлупу. Наиболее распростра­нен путь введения материала на ХАО. Для этого сбоку от воздуш­ного мешка ножницами снимают скорлупу и слегка надрывают скорлупную оболочку. Вслед­ствие давления воздуха ХАО за­падает, и на нее шприцем наносят 0,1-0,2 мл исследуемого материа­ла. Прокалывая ХАО и погружая иглу на 1-2 мм, тем же количест­вом материала заражают аллантоисную полость. Для введения материала в амниотическую полость сложенными бран-шами пинцета осторожно прокалывают хорионаллантоис, захватывают амниотическую оболочку, приподнимают и после введения в ее полость 0,05-0,10 мл материала, опус­кают. Отверстие в скорлупе закрывают стерильным по­кровным стеклом или стеклянным колпачком и заливают парафином.

С меньшей долей вероятности в амниотическую по­лость удается ввести вирусный материал через прокол в центре тупого конца яйца, ориентируясь на местоположе­ние эмбриона по его тени на скорлупе. Таким путем отно­сительно легко удается заразить эмбрион в желточный мешок, поместив яйцо на подставку тупым конусом впра­во и погружая иглу шприца на 3-4 см вглубь. Попав в желточный мешок, в него вводят 0,2-1,0 мл материала. Отверстие в скорлупе заливают каплей парафина.

Зараженные эмбрионы помещают в термостат, в кото­ром поддерживается определенная влажность. Время ин­кубации эмбрионов и температурный режим зависят от свойств исследуемого вируса. Так, ортомиксовирусы необ­ходимо культивировать при температуре 33 °С, возбуди­тель натуральной оспы — не выше 38,5 °С и, как исключе­ние, вирус вакцины - при 40 °С. Размножаясь в курином эмбрионе, вирусы на ХАО вызывают появление белесова­тых куполообразных бляшек (поксвирусы), задержку раз­вития и его гибель (тогавирусы), накопление в эмбрио­нальных жидкостях гемагглютининов и других антигенов (орто- и некоторые парамиксовирусы).

При вскрытии эмбрионов материал забирают в следую­щем порядке: 1) отсасывают аллантоисную, затем амнио­тическую жидкость; 2) разрезают ХАО и содержимое всего яйца выливают в чашку Петри; 3) отделяют амниотичес­кую оболочку, эмбрион и желточный мешок, захватив его за пупочный канатик; 4) последней извлекают ХАО. При этом пытаются обнаружить макроскопические изменения на хорионаллантоисной и амниотической оболочках.

Выделение вирусов в организме животных. В организ­ме животных культивируют те вирусы, которые плохо или совсем не размножаются в культурах клеток и кури­ном эмбрионе. При этом, выделяя коксаки-, тога- и арена-вирусы, материалом предпочтительнее заражать мышей-сосунков, а в случаях, требующих выделения онкогенных вирусов, - сосунков белых крыс и сирийских хомяков.

Количественный выход (титр накопления) вирусов в организме животных во многом зависит от их тропизма и, следовательно, от путей инфицирования, определяющих возникновение и развитие вирусной инфекции. Поэтому, выделяя нейротропные вирусы (рабдо-, тога-, буньявиру-сы), патологический материал надо вводить под твердую мозговую оболочку или в вещество головного и спинного мозга. Респираторные вирусы выделяют путем интрана-зального заражения наркотизированных белых мышей (ортомиксовирусы), инокуляцией содержимого носоглот­ки в слизистую оболочку защечных мешков сирийских хомяков (аденовирусы), введением содержимого везикул в скарифицированную кожу и конъюнктиву глаза кроли­ков и морских свинок (покс- и герпесвирусы).

Отдельные вирусы вызывают у животных развитие ха­рактерных параличей (лисса- и тогавирусы); специфичес­кие патогистологические изменения в тканях, например в межлопаточном буром жире (пикорна- и тогавирусы); об­разование папул и везикул на коже и коньюнктиве глаза (поксвирусы) и другие проявления.

Изучив патогенные эффекты вирусов в клеточном моно­слое, курином эмбрионе и организме животного, выделен­ный вирус на заключительном этапе вирусологического ис­следования идентифицируют в серологических реакциях.

Серотипаж вирусов

В серотипаже вирусов используют многие серологичес­кие реакции: РИФ, ИФА, РИА, иммуноферритиновую, РСК, РПГ, РНГП, но чаще всего реакцию нейтрализации (РН) вирусов, реакцию торможения гемагглютинации (РТГА) и реакцию торможения гемадсорбции (РТГадс), являющихся модификациями РН.

РН и ее модификации. РН вирусов воспроизводится в трех вариантах: на культурах клеток; куриных эмбрио­нах; животных (рис. 114). В любом из них при ее поста­новке взвеси инфицированных вирусом клеток, жидкос­тей различных полостей куриного эмбриона или суспен­зий пораженных тканей животных смешивают с различ­ными разведениями диагностической противовирусной сыворотки или, наоборот, разные разведения вируса до­бавляют к цельной неразведенной иммунной сыворотке. Смеси инкубируют в термостате в течение 1-2 ч при тем­пературе 37 °С или помещают в холодильник на 18 ч при

температуре 4 °С, и вслед за этим заражают монослой кле­ток, куриные эмбрионы и животных. О нейтрализующей силе противовирусных антител на клеточном пласте судят по его нормальному развитию в течение 10-15 сут, а на ку­риных эмбрионах и животных - по выживанию и отсут­ствию изменений на ХАО (2-3 сут) и в тканях животных (5-7 сут).

В тех случаях, когда идентифицируются вирусы, вы­зывающие обширную деструкцию клеточного пласта, РН ставят под агаровым покрытием. Для этого из флакона с монослойной культурой клеток удаляют питательную среду и заражают ее взвесью вируса. Через 30-60 мин пос­ле адсорбции вируса на клетках монослой покрывают 3 %-ным расплавленным агаром, содержащим лошади­ную сыворотку, солевые добавки и как индикатор - ней­тральный красный. Зараженную вирусом культуру кле­ток помещают в термостат. В контрольных флаконах при нормальном росте клеток в результате выделения ими ме­таболитов происходит подкисление среды и монослой рав­номерно окрашивается индикатором в розовый цвет. В опытных флаконах монослой пестрит — розовые участки клеток, не пораженные вирусами, перемежаются с мелки­ми беловатыми островками-бляшками различной конфи­гурации, специфичными для того или иного вируса.

Идентификация вирусов по их цитопатическому и па­тогенному действию в РН требует длительного времени, немалых усилий и умения. Гораздо легче видовую при­надлежность вирусов установить в РТГА или РТГадс, представляющих собой РН антисыворотками вирусных гемагглютининов.

РТГА.Большинство вирусов обладают способностью агглютинировать определенные эритроциты. Так, вирусы гриппа и эпидемического паротита агглютинируют эрит­роциты кур, морских свинок, человека; вирус клещевого энцефалита - эритроциты барана; вирусы японского энце­фалита - эритроциты однодневных цыплят и гусей; адено­вирусы - эритроциты крыс, мышей, обезьян. В связи с этим для их обнаружения в материале больных или куль­турах клеток, эмбрионов и животных ставят реакцию ге­магглютинации (РГА). Для этого в лунках плексигласо­вых планшет готовят двукратно возрастающие разведе­ния вируссодержащих жидкостей в объеме 0,5 мл, добавляя к ним по 0,25 мл 2 %-ной взвеси эритроцитов, триж­ды отмытых изотоническим раствором натрия хлорида. Для контроля спонтанной агглютинации 0,5 мл эритроци­тов смешивают с равным объемом изотонического раствора натрия хлорида. Смеси инкубируют в термостате при тем­пературе 37 °С или в холодильнике при 4 °С, но можно оста­вить при комнатной температуре. Результаты РГА учиты­вают по характеру агглютинации эритроцитов через 30-60 мин, когда они полностью осаждаются в центре конт­рольной лунки, образуя плотный осадок в виде «пугови­цы». Положительная реакция обозначается плюсами: «++++» - звездчатой формы осадок с фестончатыми края­ми в виде «зонтика», покрывающего всю лунку; «+++» -осадок с просветами; «++» - осадок с большими просвета­ми; «+» - хлопьевидный осадок, окруженный зоной ском-кованных эритроцитов; «—» - такой же резко очерченный осадок эритроцитов, как и в контроле. При помощи РГА оп­ределяют также титр вируса или наибольшее его разведение, при котором еще наблюдается агглютинация эритроцитов, что соответствует одной гемагглютинирующей единице.

Являясь группоспецифической, РГА не дает возмож­ности определить видовую принадлежность вирусов. Их идентифицируют с помощью РТГА. Для ее постановки ис­пользуют диагностические противовирусные сыворотки, которые в двукратно снижающихся концентрациях разво­дят в изотоническом растворе натрия хлорида и разливают по 0,25 мл. К каждому их разведению добавляют равное количество вируссодержащей жидкости, при типировании вируса гриппа, например, в четырехкратном титре (т. е. 4 гемагглютинирующие единицы). Контролем является взвесь вируса в изотоническом растворе натрия хлорида. Планшеты со смесью сывороток и вируса выдерживают в термостате 30 мин или при комнатной температуре 2 ч, за­тем в каждую из них добавляют по 0,5 мл 1 % -ной взвеси эритроцитов. Спустя 30-45 мин определяют титр вирус-нейтрализующей сыворотки, т. е. максимальное ее разве­дение, вызвавшее задержку агглютинации эритроцитов.

РТГадс. По своей сути РТГадс является аналогом РТГА. Производится она на двух зараженных вирусами монослойных культурах клеток, одна из которых предва­рительно обрабатывается диагностической сывороткой, нейтрализующей вирусные гемагглютинины. В тот и дру­гой монослой при ее постановке вводят 0,2 мл 0,4 %-ной взвеси отмытых изотоническим раствором натрия хлори­да стерильных эритроцитов, чувствительных к гемагглю-тинирующему действию предполагаемого вируса. Про­бирки ставят в наклонном положении на 30 мин в термо­стат при температуре 37 °С (или оставляют при комнатной температуре), затем помещают во вращающийся барабан для удаления неадсорбированных эритроцитов. Учитыва­ют РТГадс, используя малое увеличение микроскопа. Ее считают положительной, если в опытном монослое, обра­ботанном антисывороткой, отсутствует реакция гемадсорб-ции, а на интактном - отмечается диффузная или локаль­ная реакция адсорбции эритроцитов в виде небольших скоплений, гроздей и розеток.

Серодиагностика вирусных инфекций

Прибегая к ней, учитывают, что антитела по отноше­нию к вирусам вырабатываются медленно. В связи с этим исследуется динамика нарастания титра антител, для че­го серологические реакции ставят с сыворотками, одна из которых берется от больного в разгаре вирусной инфек­ции, скажем, спустя 5-7 сут от начала, а другая (другие) -через 2-3-4 недели, когда титр антител у детей законо­мерно удваивается, а у взрослых - достигает четырехкрат­ного увеличения. Основанная на этой методологии сероди­агностика по точности не уступает серотипажу, более проста по технике выполнения, но природа вирусной ин­фекции с ее помощью устанавливается чаще всего уже после перенесенного заболевания. И тем не менее ретро­спективный, или запоздалый, диагноз имеет большую ценность для практического врача в тех случаях, когда вслед за перенесенной вирусной инфекцией возникают осложнения, а для эпидемиолога - при разработке проти­воэпидемических мер, исключающих рассеивание инфек­ции. Серодиагностика осуществляется с помощью тех же реакций, которые применяются для серотипажа вирусов; в качестве антигена используются производственные ви­русные диагностикумы, взвеси вирусных культур и даже сыворотки выздоравливающих больных, содержащие ви­русные антигены.

«Вирусы гепатитов»

Дата добавления: 2015-06-30; просмотров: 390; Нарушение авторских прав

Мы поможем в написании ваших работ!