Этапы приготовления постоянного гистологического препарата

1. Взятие материала. Размеры объекта 7х7х3 мм не более

1см³. Материал должен быть свежим. Во время взятия материала необходимо избегать лишней его травматизации;

2. Фиксация материала. Фиксация производится путем погружения объекта в фиксирующую жидкость. Цель этого этапа - закрепление гистохимических структур в том состоянии, в котором они находились при жизни. Для фиксации используют фиксаторы, которые могут быть простыми и сложными. Простые - спирты (этиловый, метиловый), формалин, соли тяжелых металлов, кислоты (уксусная, пикриновая, осмиевая). Сложные - фиксаторы, состоящие из нескольких простых в определенном соотношении. Фиксаторы должны обладать бактерицидными свойствами.

3. Промывка проводится для удаления фиксатора из объекта в проточной воде в течение 24 часов.

4. Обезвоживание объекта. Для этого используют спирты возрастающей концентрации от 60⁰ до 100⁰.

5. Уплотнение объекта - осуществляется последовательно в несколько этапов: парафин, целоидин, синтетические смолы. Эта процедура еще носит название заливки.

6. Изготовление срезов - для этого используются микротомы и ультрамикротомы. С помощью микротомов готовятся тонкие (5-7 мкм) и полутонкие (0,5-1 мкм) срезы, ультрамикротомы позволяют приготовить ультратонкие срезы ( 0,005-0,2 мкм)

7. Окраска или контрастирование срезов. Необходима для того, чтобы можно было различать структурные детали объекта, большинство которых не имеет природного контраста. Перед окраской срезы депарафинируются ксилолом, потом ксилол удаляют при помощи батареи спиртов нисходящей концентрации от 100⁰ до 60⁰ и промываются водой. После этого на препарат наносится раствор красителя, затем краска удаляется водой.

8. Заливка срезов канадским бальзамом с целью длительного хранения препаратов. Этот этап также состоит из нескольких стадий, включающих: обезвоживание в спиртах возрастающей концентрации (от 60⁰ до 100⁰), осветление в ксилоле, заливка среза тонким слоем канадского бальзама, покрытие покровным стеклом.

Для окраски препаратов используется целый ряд различных красителей. Все гистологические красители в зависимости от происхождения делятся на:

1) растительные; 2) животные; 3) синтетические.

ЁК растительным красителям относится - гематоксилин.

ЁК животным относится - кармин.

ЁВсе остальные красители являются синтетическими. Это - эозин,

фуксин, азур и другие.

По химическим свойствам все красители делятся на:

1) кислые; 2) основные; 3) нейтральные; 4) специальные.

Кислые - это красители, свойства которых определяются наличием химических групп - СООН, - НSO^-₃, - Н₂РО^-_3. Их еще называют анионными, они окрашивают цитоплазму. К этой группе относится эозин, ясный зеленый. Гистологические структуры, которые окрашиваются кислыми красителями называются оксифильными (ацидофильные, эозинофильные).

Основные - это катионные красители и подавляющее большинство их в своем составе имеет атом азота с положительным зарядом. Эти красители избирательно окрашивают ядра клеток и поэтому их называют ядерными. К таким красителям относятся гематоксилин, кармин, сафранин. Гистологические структуры, которые окрашиваются основными красителями называются базофильными.

Необходимо отметить, что они способны окрашивать и цитоплазму в тех случаях, когда в ней содержится большое количество ДНК и нуклеиновых кислот или кислых гликозаминогликанов.

Нейтральные - образуются при соединении водных растворов кислого и основного красителей, например: эозиново-кислый, метиленовый синий. Гистологические структуры, которые одновременно воспринимают и кислые и основные красители называются нейтрофильными или полихроматофильными. Некоторые гистологические структуры способны изменять цвет основного красителя. Это явление получило название метахромазии. Метахроматически красится зернистость базофильных лейкоцитов, межклеточное вещество хрящевой ткани.

Специальные красители, которые используют для окрашивания определенных веществ, структур или тканей. Это судан III - красит жировую ткань, орсеин - эластические волокна.

Витальные (прижизненные) методы исследований

Эти методы исследований дают возможность получить информацию каким образом в клетках, тканях, органах происходят процессы жизнедеятельности, проследить движение, деление, рост, взаимодействие клеток, их реакцию на действие различных факторов.

При исследовании живых клеток используют методы витального и суправитального окрашивания, используя специальные не токсические для живых тканей красители.

При витальном окрашивании краситель вводят в организм живого организма и он избирательно окрашивает определенные клетки. Таким образом проводят исследования макрофагической системы, введением трипанового синего, или литиевого кармина.

Суправитальное окрашивание - это окрашивание живых клеток изолированных от организма.

Таким образом определяют:

~лизосомы - краситель нейтральный красный;

~митохондрии - янус зеленый;

~ретикулоциты - диамант-крезиловый синий.

При витальном, суправитальном, а также поствитальном исследовании неокрашенных гистологических структур, используют ряд специальных методов световой микроскопии:

1) Фазовоконтрастную;

2) Темнополевую;

3) Флуоресцентную.

В последнее время существенное значение имеют методы гистохимии, авторадиографии, иммуноморфологии, цитоспектрофотометрии.

Гистохимические методы позволяют определить локализацию различных химических соединений в клетке и их структурных компонентов, а также их количественное содержание.

Авторадиоографический метод. В основе этого метода лежит использование радиоактивных изотопов и меченых ими соединений. Эти соединения вводятся в организм, а потом радиоактивные вещества обнаруживают на срезах при помощи специального оборудования.

Иммуногистохимические методы основаны на реакциях антиген-антитело. Известно, что каждая клетка организма имеет специальный антигенный состав, который в большинстве определяется белками. Путем иммунизации можно получить соответствующие антигенам антитела. Антитела связывают с флюорохромами или ферментами. После специальной обработки исследованных препаратов в местах локализации соответствующих антигенов концентрируются молекулы меченых антител, которые обнаруживают благодаря свечению или вследствие образования окрашенных структур в гистохимической реакции.

Цитоспектрофотометрия - метод позволяющий проводить количественное измерение содержания различных веществ в клетке на основе изучения спектров поглощения ими световых лучей.

Метод проточной цитометрии - позволяет анализировать характеристики клеток в суспензии, которую пересекает сфокусированный лазерный луч.

Таким образом, вышеизложенное еще раз свидетельствует о том, что гистология является одной из фундаментальных морфологических дисциплин и по сути является базовой в теоретической подготовке врача.

ЦИТОЛОГИЯ

Цитология - наука о клетке. Название происходит от греческих слов ( kytos- клетка, ячейка, logos-учение).

Цитология изучает строение и функции клеток и их производных, исследует отдельные клеточные структуры, их участие в общеклеточных физиологических процессах, пути регуляции этих процессов, репродукцию клеток и субклеточных структур, приспособление клеток к условиям среды, их реакцию на действие различных факторов, патологические изменения клеток.

В связи с этим цитология имеет очень большое значение при изучении различных видов патологических состояний, так как все они сопровождаются нарушениями функций клеток.

Клетка (cellula) - это элементарная живая единица организма, которая отграничена от окружающей среды активной мембраной и представляет структурно упорядоченную систему биополимеров, образующих ядро, цитоплазму, а также другие субклеточные компоненты (органеллы и включения) и принимает участие в единой совокупности метаболических процессов, направленных на обеспечение поддержки и восстановления системы в целом.

Клетки в живых организмах могут быть двух типов:

1) содержащие ядро - эукариотические;

2) не содержащие ядро - прокариотические.

Организмы, состоящие из эукариотических клеток называются эукариотами, а из прокариотических - прокариотами. Большинство растительных и животных организмов являются эукариотами. К прокариотам относятся только бактерии и сине-зеленые водоросли.

Клеточная теория. Неклеточные структуры.

Клеточная теория является теоретической основой биологии и медицины, и представляет фундаментальное обобщение представлений о строении клеток, как единиц живого, о их репродукции и роли в формировании многоклеточных организмов.

Появлению и формированию отдельных положений клеточной теории предшествовал очень длительный процесс (более 300 лет) накопления сведений о строении одно- и многоклеточных организмов. Полученные в процессе исследований многочисленные данные разных ученых (Роберт Гук, 1665, Мальпиги М., Грю Н., Левенгук ХVII в., Пуркинье Я., Браун Р., XIX в.), а также собственные наблюдения позволили Теодору Шванну (1838) сформулировать основные положения клеточной теории, которые он изложил в 1839 г. в книге «Микроскопические исследования о соответствии в структуре и росте животных и растений».

Дата добавления: 2014-09-10; просмотров: 1431; Нарушение авторских прав

Мы поможем в написании ваших работ!