Фотодыхание

Хемиосмотический механизм синтеза АТР. Механизм фосфорилирования ADP, сопряженный с работой электрон-транспортной цепи на сопрягающих мембранах, объясняет хемиосмотическая теория, разработанная в 1961-1966 гг. применительно к митохондриям английским биохимиком, Нобелевским лауреатом 1978 г. Питером Мит­челлом. Он ввел понятие сопрягающей мембраны, т. е. мембраны, на которой процесс транс­порта протонов сопряжен с процессом синтеза АТР. Такие мембраны, по его мнению, должны быть непроницаемы для протонов и иметь электрон-транспортную цепь, в ко­торой переносчики электронов и протонов чередуются с переносчиками только электро­нов'. Сущность теории Митчелла можно свести к двум положениям: во-первых, элек­трон-транспортная цепь функционирует таким образом, что на мембране возникает электрохимический градиент ионов Н+, а во-вторых, обратный ток ионов Н+ через протонный канал сопровождается образованием энергии фосфатной связи АТР. Первоначально его теория обясняла механизм синтеза АТФ в митохондриях.

В 1967 г. Андреа Ягендорф использовал теорию Митчелла для объяснения процессов фотпофосфорилирования на тилакоидной мембране. Изолированные из хлоропластов граны с рН 8 помещали в буферный раствор с рН 4. После инкубации рН в гранах выравнивался до 4. Затем граны с рН 4 переносились в буферный раствор с рН 8. Таким образом на тилакоидных мембранах искусственно задавался градиент протонов, который обычно формируется при фотохимических процессах (внутри тилакоида —рН 4, а снаружи — рН 8). В этих условияхосле добавления в среду ADP и Р_н в темноте синтезировалась АТР. Эти эксперименты являются хорошим подтверждением применимости хемиосмотической теории Митчелла для объяснения процессов, происходящих при фотофосфорилировании в хлоропластах.

Сам процесс синтеза АТФ обясняет обменно-связывающий механизм синтеза АТФБойера, который включает три принципиальных положения.

• Основным этапом, требующим энергии, является не синтез АТР из ADP и Р_н, а процесс отделения АТР от фермента.

• В АТР-синтазном комплексе связывание субстратов и высвобождение продуктов реакции происходит в трех отдельных, но взаимодействующих между собой катали­тических участках фермента. При этом каждый каталитический участок может суще­ствовать только в одном из трех конформационных состояний.

• Поток ионов Н⁺ через протонный канал Fo по градиенту электрохимического потенциала вызывает вращение Ў-субъединицы АТР-синтазного комплекса. Это вра­щение приводит к конформационным изменениям в каталитических участках, которые позволяют АТР высвобождаться от фермента и процессу идти дальше.

Опыт который позволил доказать вращение субъединицы в АТР- синтезирующем комплексе.

Два первых постулата Бойера получили много подтверждений, основанных главным образом на анализе кинетики процесса, и являются общепринятыми. Утверждение же о вращательном механизме процесса сопряжения между потоком Н⁺ и синтезом АТР доказать было сложнее. Это удалось сделать группе английских исследователей в ла­боратории Джона Уокера в Кембридже. Они провели высоко разрешающий кристаллографический анализ структуры Fi-комплекса АТРазы митохондрий быка. Выло выявлено, что в каталитический комплекс входят три β- и три α-субъединицы, которые расположены, чередуясь подобно долькам апель­сина . Три α/β гетеродимера отличаются друт от друга и конформационно, и по связанным с ними нуклеотидам, что подтверждает наличие механизма синтеза АТР по принципу связывание-обмен. При этом Ў -субъединица, как стержень, вставлена внутрь каталитического комплекса. Между а- и β -субъединицами обнаружены высокогидро­фобные взаимодействия, что обеспечивает возможность вращения Ў -субъединицы внут­ри полости, образуемой в каталитическом центре фермента.

После анализа кристаллической структуры Fj-комплекса АТР-синтазы были сняты практически все вопросы, касающиеся механизма синтеза АТР. Однако окончательное доказательство вращения Ў -субъединицы в каталитическом центре фермента можно было бы получить, если бы его удалось зарегистрировать визуально. Такой экспери­мент удалось провести Масасуке Ешида с коллегами в Токийском технологическом институте Японии. Они пометили флуоресцент­ным зондом актиновый филамент и «пришили» его к Ў -субъединице F1-комплекса. Затем комплекс F1 был прикреплен к специально обработанной стеклянной поверхно­сти, по которой невозможно скольжение (рис.). Исследователи предположили, что если Ў -субъединица действительно способна вращаться под действием АТР, то будет вращаться и прикрепленный к ней актиновый филамент. Поскольку размеры фила мента составляли около 1 мкм, его вращение должно быть видно во флуоресцентный микроскоп.

Результаты эксперимента оказались потрясающими. Как только к модифицирован­ному комплексу F1 была добавлена АТР, актиновые филаменты начинали вращаться по кругу со средней скоростью

4 оборота в секунду. Посколь­ку размеры актинового филамента значительно превышали размеры ферментативного комплекса, реальная скорость вращения Ў -субъединицы должна быть гораздо выше. Демонстрация вращательного движения Ў -субъединицы позволила окончательно ре­шить вопрос омеханизме синтеза АТР в А'ГР-синтазном комплексе.Согласно современной модели функционирования АТР-синтазного комплекса хлоропластов источником энергии для мембранного транспорт протонов является градиент (протондвижущая сила) на мембране тиллакоидов. Движение ионов Н⁺ по протонному каналу АТР-синтазы вызывает вращение 111- субъединичного комплекса внутри мембраны. Это инициирует вращениеЎ -субъединицы, тесно связанной с Fo-комплексом. Вращение Ў -субъединицывнутри F1-комплекса вызывает конформационные измене­ния в каталитическом центре, необходимые для синтеза АТР. Предполагается, что каталитический комплекс сам по себе не вращается и крепится к мембране с помощью а-, Ь- и ∆-субъединиц. В терминах электротехники F1-комплекс и его мембранный «якорь» (субъединицы а и Ь) сравнивают со статором, в то время как Ў -субъединицу и вра­щающуюся часть Fo-комплекса — с ротором. За свой вклад в установление механизма синтеза АТР П.Бойер и Д. Уокер в 1997 г. получили Нобелевскую премию.

Путь углерода в фотосинтезе (темновоя фаза фотосинтеза)

В результате фотохимических реакций в хлоропластах создается необходимый уровень АТР и NADPH. Эти конечные продукты световой фазы фотосинтеза стоят на входе в темновую фазу, где С02восстанавливается до углевода.

Однако сами по себе АТР и NADPH не в состоянии восстановить С0₂. Очевидно, и темновая фаза фотосинтеза — сложный процесс, включающий большое количество реакций. Кроме того, существуют различные пути восстановления СО2,. В настоящее время известны так называемые С₃-путь и С₄-путь фиксации С0₂, фотосинтез по типу толстянковых (САМ-метаболизм) и фотодыхание. Рассмотрим каждый из этих путей в отдельности.

Этот способ ассимиляции С0₂, присущий всем растениям, в 1946—1956 гг. был расшифрован американским биохимиком М. Кальвином и его сотрудниками. Прежде всего была поставлена задача обнаружить первичный продукт фотосинтеза и выяснить, какое соединение служит акцептором С0₂.

Для решения первого вопроса были использованы одно­клеточные зеленые водоросли (хлорелла и др.) и меченый

¹⁴С0₂. Фотосинтезирующие водоросли помешали в среду, со­держащую ¹⁴С0₂, на разные промежутки времени, затем клетки быстро фиксировали, экстрагировали из них спирторастворимые вещества и определяли содержание ¹⁴С в различных соединениях после их разделения с помощью хроматографии. Оказалось, что после экспозиции в течение I мин 14С вклю­чался в С3—С7-сахара и фосфосахара, в органические кислоты (яблочную, щавелевоуксусную, ФЕП), в аминокислоты (аланин, аспарагиновую кислоту). Если же время экспозиции было сокращено до 0,1—2 с, то большая часть метки обнару­живалась в фосфоглицериновой кислоте, в ее карбоксильной группе.

Следовательно, 3-фосфоглицериновая кислота (ФГК) является первичным продуктом фотосинтеза.

Второй вопрос — природа первичного акцептора С02. Сначала предположили, что таким акцептором является какое-либо двухуглеродное соединение. Однако введение в инку­бационную среду винилфосфата, фосфогликольальдегида и дру­гих веществ с С2не приводило к увеличению содержания радиоактивной метки из С02в ФГК. Тогда схему опыта видоизменили следующим образом. Водоросли экспонировали на свету при высокой (1 %-ной) концентрации С02, затем резко снижали его концентрацию до 0,003%. Расчет был на то, что в условиях дефицита С02быстро накопится именно то соединение, которое служит акцептором С02. С помощью двумерной хроматографии удалось установить, что при отсут­ствии возможности карбоксилирования в клетках кратко­временно возрастает концентрация рибулозо-1,5-дифосфата (рибулозо-1,5-бисфосфата). Отсюда возникло предположение, что первичная фиксация С02происходит следующим образом: С5+ С02 ► С6—-» 2С3.

Эта реакция катализируется рибулозодифосфаткарбоксилазой (рибулозобисфосфаткарбоксилазой; другие названия — белок фракции I, карбоксидисмутаза). Максимум активности фермент имеет при рН 7,8-8,0 и нуждается в присутствии ионов Mg^{2 +} .

Дальнейшая работа в лаборатории Кальвина и в других лабораториях привела к расшифровке всех последующих реакций С₃-пути фотосинтеза, который получил название цикла Кальвина (рис. 3.13). Этот цикл, весьма напоминающий обращенный пентозофосфатный путь дыхания, состоит из трех этапов: карбоксилирования, восстановления и регене­рации.

1) Карбоксилирование. Молекулы рибулозо-5-фосфата фосфорилируются с участием АТР и фосфорибулозокиназы, в результате чего образуются молекулы рибулозо- 1,5-дифосфата, к которым в свою очередь присоединяется С0₂ с помощью рибулозодифосфаткарбоксилазы. Полученный продукт расщепляется на две триозы: 2 молекулы 3-фосфо- глицериновой кислоты (3-ФГК).

2)Фаза восстановления. 3-ФГК восстанавливается до 3-фосфоглицеринового альдегида (3-ФГА) в два этапа. Сначала происходит фосфорилирование 3-ФГК при участии АТР и фосфоглицераткиназы до 1,3-дифосфоглицериновой кислоты, а затем восстановление 1,3-ФГК с помощью NADPH и дегидрогеназы фосфоглицеринового альдегида.

3)Фаза регенерации первичного акцептора диоксида углерода и синтеза конечного продукта фотосинтеза. В резуль­тате описанных выше реакций при фиксации трех молекул С<Э₂ и образовании шести молекул восстановленных 3-фосфотриоз пять из них используются затем для регенерации рибулозо- 5-фосфата, а один — для синтеза глюкозы. 3-ФГА под дейст­вием триозофосфатизомеразы изомеризуется в фосфодиоксиацетон. При участии альдолазы 3-

ФГА и фосфодиоксиацетон конденсируются с образованием фруктозо-1,6-дифосфата, у кото­рого отщепляется один фосфат с помощью фруктозо-1,6- дифосфатазы. В дальнейших реакциях, связанных с регенера­цией первичного акцептора С0₂, последовательно принимают участие транскетолаза и альдолаза. Транскетолаза катали­зирует перенос содержащего два углерода гликолевого альде­гида от кетозы на, альдозу.

Альдолаза затем осуществляет перенос трехуглеродного остатка фосфодиоксиацетона на альдозу, в данном случае на эритрозо-4-фосфат, в результате чего синтезируется седо- гептулозо-1,7-Дифосфат. Последний дефосфорилируется и под действием транскетолазы из него и 3-ФГА образуются ксилулозо-5-фосфат и рибозо-5-фосфат. Две молекулы ксилуло- зо-5-фосфата при участии рибулозофосфатэпимеразы и одна молекула рибозо-5-фосфата с участием рибозофосфатизомеразы превращаются в три молекулы рибулозо-5-фосфата, с которого начинается новый цикл фиксации С0₂.

Из оставшейся неиспользованной 6-й молекулы 3-ФГА под действием альдолазы синтезируется (при повторении цикла) молекула фруктозо-1,6-дифосфата, из которой могут образо­вываться глюкоза, сахароза или крахмал.

Таким образом, для синтеза одной молекулы глюкозы в цикле Кальвина необходимы 12 NADPH и 18 АТР (рис. 3.13), которые поставляются в результате фотохимических реакций фотосинтеза. .

С4 путь фиксации СО2.

В работах А. Незговоровой (1956-1957 гг.), было установлено, что при коротких экспозициях листьев кукурузы на свету ¹⁴С из ¹⁴С0₂ обнаруживается в аспарагиновой кислоте. В дальнейших исследованиях как советских, так и зарубежных специалистов эти представления были развиты, что привело к открытию С_л-пути углерода в фотосинтезе. Так, в 1960 г. Ю. С. Карпилов, а в 1963 г. И. А. Тар- чевский и Ю. С. Карпилов представили данные о раннем образовании яблочной кислоты в листьях кукурузы. Г. П. Корчак и др. (Kortschak et al., 1965) впервые показали, что дикар- боновые кислоты (яблочная и аспарагиновая) являются первич­ными продуктами фиксации С0₂ у сахарного тростника. Затем эти соединения через 3-ФГК и гексозофосфаты превращаются в сахара. Как новый тип фиксации С0₂, принципиально отличающийся от цикла Кальвина, этот цикл впервые описали австралийские ученые М. Д. Хетч и К. Р. Слэк (1966). К группе растений с С₄-путем фотосинтеза относятся сахарный тростник, кукуруза, сорго и др. Листья этих растений содержат два разных типа хлоро­пластов: хлоропласты обычного вида — в клетках мезофилла и

большое количество крупных хлоропластов, часто не имеющих гран, — в клетках, окружающих проводящие пучки (обкладка). С0₂, диффундирующий в лист через устьица, попадает в цитоплазму клеток мезофилла, где при участии ФЕП-карбокси- лазы вступает в реакцию с ФЕП, образуя щавелево- уксусную кислоту (оксалоацетат). Затем уже в хлоропластах оксалоацетат восстанавливается до яблочной кислоты (малата) за счет NADPH, образующего в ходе световой фазы фотосинтеза (рис. 3.14). Щавелевоуксусная кислота в присут­ствии NH₄ может превращаться также в аспартат. Затем малат (или аспартат) переносится в хлоропласты клетки обклад­ки сосудистого пучка, где он декарбоксилируется малик-энзимом (малатдегидрогеназой декарбоксилируюшей) до пирувата и С0₂.

Как уже отмечалось, в хлоропластах обкладки отсутствуют граны, а следовательно, слабо представлена ФС II, необходимая для нециклического транспорта электронов, однако в них в изобилии накапливается крахмал. Объясняется это тем, что в хлоропластах обкладки используется поставляемый малик- энзимом NADPH, а также тот С0₂, который образовался при окислительном декарбоксилировании малата (или аспар- тата). В этих хлоропластах в процессе циклического фото­фосфорилирования синтезируется большое количество АТР и фиксация С0₂ осуществляется по типу цикла Кальвина. У некоторых растений с С₄-путем фотосинтеза (амарант, лебеда) яблочная кислота декарбоксилируется в митохондриях клеток обкладки с восстановлением NAD.

Возникающий при расщеплении малата в хлоропластах клеток обкладки пируват перемещается назад в хлоропласты клеток мезофилла (рис. 3.14), где может снова превращаться в первичный акцептор С0₂ — ФЕП. Такая компартментация процессов позволяет растениям с С₄-путем осуществлять фотосинтез даже при закрытых устьицах, так как хлоропласты клеток обкладки используют малат (аспартат), образовавшийся ранее, как донор С0₂. С₄-растения могут также исполь­зовать С0₂, возникающий при фотодыхании (см. дальше). Закрывание устьичных отверстий в наиболее жаркое время дня сокращает потери воды за счет испарения (транспирации). Не удивительно поэтому, что к С₄-растениям относятся многие виды засушливой тропической зоны. Растения с С₄- путем фотосинтеза, как правило, устойчивы к засолению. Эффективность использования воды, т. е. отношение массы ассимилированного С0₂ к массе воды, израсходованной при транспирации, у С₄-растений зачастую вдвое выше, чем у С₃-растений. Таким образом, С₄-растения имеют преиму­щества перед С₃-растениями в засушливых местах обитания благодаря высокой интенсивности фотосинтеза даже при закрытых устьицах. Фиксация С0₂ с участием ФЕП и образова­ние малата (аспартата) служит как бы насосом для поставки С0₂ в хлоропласты обкладки, функционирующие по С₃-пути.

Фотосинтез по типу Толстянковых. Суккуленты (роды Crassula, Bryophyllum и др.) при­способились осуществлять фотосинтез в условиях резко засуш­ливого климата. Для них характерен суточный цикл мета­болизма С₄-кислот с образованием яблочной кислоты ночью.

«В соответствии с английским выражением crassulacean acid metabolism (САМ) этот тип фотосинтеза часто сокращенно называют САМ-метаболизм. Устьица этих растений днем обыч­но закрыты, что предотвращает потерю воды, и откры­ваются ночью. С0₂ поступает в листья, где при участии содержащейся в цитоплазме ФЕП-карбоксилазы взаимодей­ствует с фосфоенолпируватом, образуя оксалоацетат. Источни­ком ФЕП служит крахмал. То же самое происходит и с С0₂, который освобождается в клетках в процессе дыхания. Образовавшийся оксалоацетат восстанавливается под действием NADH-зависи.мой малатдегидрогеназы до яблочной кислоты, которая накапливается в вакуолях клеток листа (рис.). Это приводит к закислению клеточного сока в ночное время. Как и у С₄-растений, оксалоацетат может быть источником аспартата, однако этот путь здесь менее выражен.

Днем в условиях высокой температуры, когда устьица закрыты, малат транспортируется из вакуолей в цитоплазму и там декарбоксилируется при участии малатдегидрогеназы декарбоксилирующей (малик-энзима) с образованием С0₂ и пирувата. С0₂ поступает в хлоропласты и включается в них в цикл Кальвина, участвуя в синтезе Сахаров.

Таким образом, у растений с фотосинтезом по типу толстянковых много общего с С₄-путем фотосинтеза. Однако при САМ-мстаболизме фиксация С0₂ с образованием малата (ночью) и декарбоксилироваиие малата с высвобождением СО, и пирувата (днем) разделены во времени. У С₄-расгений эти же реакции разграничены в пространстве: первая протекает в хлоропластах мезофилла, вторая - в клетках обкладки. При достаточном количестве воды ряд растений с метаболизмом по типу толстянковых могут вести себя как С₃-растсния. В свою очередь некоторые растения с С₃-путем фото­синтеза при недостатке воды проявляют черты САМ-метаболизма.

В растительных клетках, содержащих хлоропласты, помимо С3- и С₄-путей фотосинтеза, осуществляется также фотодыхание, т. с. активируемый светом процесс высвобождения СО2, и поглощения О2,, который значительно отличается от «темнового» дыхания митохондрий. Так как при этом пер­вичным продуктом является гликолевая кислота, то этот путь получил название гликолатного. У .некоторых С₃-растений с малой эффективностью фотосинтеза интенсивность фотодыха­ния может достигать 50% от интенсивности фотосинтеза.

Фотодыхание у C3-растений обычно усиливается при низком содержании С0₂ и высоких концентрациях 0₂. В этих условиях РДФ-карбоксилаза в хлоропластах может функциони­ровать как оксигеназа, катализируя окислительное расщепление рибулозо-1,5-дифосфата на 3-ФГК и 2-фосфогликолевую кисло­ту, которая затем дефосфорилируется в гликолевую кислоту (рис.). Молекулы С0₂ и 0₂ конкурируют между собой в каталитическом центре РДФ-карбоксилазы: при относитель­но высоких концентрациях С0₂ и низких 0₂ преобладает карбоксилирование, тогда как высокие концентрации 0₂ и низкое содержание СО2, благоприятствуют окислению, а следовательно, и образованию фосфогликолевой кислоты. В том же направлении действует и повышение температуры.

Фотодыхание осуществляется в результате взаимодействия трех органелл — хлоропластов. пероксисом и митохондрий (рис.). Гликолат из хлоропласта поступает в пероксисому и там окисляется гликолатоксидазой до глиоксилата. Воз­никающая перекись водорода устраняется каталазой пероксисомы. Глиоксилат аминируется, превращаясь в глицин, причем в качестве донора аминогруппы функционирует глутамат.

Глицин транспортируется в митохондрию. Здесь из двух молекул глицина образуется серии и освобождается С0₂. Теперь цикл замыкается: серин может снова поступать в пероксисому и там передать свою аминогруппу на пируват. При этом из пирувата возникает аланин, из серина — гидроксипируват, который сразу после этого восстанавливается вглицерат. Затем глицерат может снова попасть в хлоропласты и благодаря фосфорилированию включиться в цикл Кальвина.

Последовательность реакций фотодыхания не обязательно образует цикл. Гликолатный путь С₃-растений может завер­шиться в митохондриях. Конечными продуктами в этом случае являются серин и С0₂. Освобождение С0₂ объясняет, почему нетто-фотосинтез (чистая продуктивность) при интенсив­ном фотодыхании снижается (рис.).

У С₄-расгений С0₂, выделяющийся в результате фото­дыхания, перехватывается в клетках мезофилла, где из ФЕП и С0₂ образуются оксалоацетат и малат. Затем малат «отдает» свой С0₂ хлоропластам

обкладки, где функциони­рует цикл Кальвина. В связи с этим становится понятным высокий нетто-фотосинтез С₄-растений.

Однако для чего же тогда нужно фотодыхание? Необходимо вспомнить, что гликолатный путь приводит к синтезу глицина и серина, в пероксисомах происходит восстановление NADP⁺; имеются косвенные данные о том, что в процессе образо­вания серина может генерироваться и АТР. Показано, что С₃-растения, помещенные в атмосферу с низким парциальным давлением 0₂ и высокой концентрацией С0₂, ведут себя подобно С₄-растениям, т. е. имеют низкий уровень фото­дыхания.

Из всего сказанного можно сделать вывод, что термин фотодыхание имеет лишь формальный смысл: 0₂ потреб­ляется, С0₂ выделяется, однако в функциональном плане к дыханию этот процесс прямого отношения не имеет.

Регуляция фотосинтеза осуществляется на уровне фотохими­чески активных мембран, хлоропластов, клеток, тканей, органов и целого организма. Все системы регуляции принимают участие в этом процессе.

Дата добавления: 2014-02-28; просмотров: 1288; Нарушение авторских прав

Мы поможем в написании ваших работ!