Метод ранней диагностики

ДИАГНОСТИКА

Диагноз ставят на оновании лабораторных исследований с учетом эпизоотологических данных, клинических признаков и патологических изменений Для выяснения причины болезни используют методы ранней и ретроспективной диагностики

Выделение вируса. Из патологического материала (клоаки печени, селезенки, яйцевода, лейкоцитов, крови, фекалий) более успешно вирус выделяют в первые 10 дн инфицирования. Используют для этого утиные эмбрионы или культуру клеток почек, печени эмбрионов уток и гусей, утиных и гусиных фибробластах, а также клетки гепатоцитов КЭ. Однако ФЭК и сами эмбрионы для этой цели не пригодны. Для выделения вируса необходимо не менее 3-х последовательных пассажей. Материалом, взятым с помощью тампона из клоаки, глотки, яйцевода, кусочками печени и селезенки, а также лейкоцитами заражают чувствительную культуру клеток. Проводят не менее 3-х последовательных пассажей с 7-10 дн интервалом. Присутствие в среде вируса EDS-76 устанавливают с помощью РГА. Обычно в сыворотке у всех экспериментально зараженных птиц в РЗГА выявлялись антигемагглютинины. В опытах, где имелась одна зараженная птица среди группы здоровых контактных птиц, последние, как правило, становились серопозитивньми, однако выделить вирус от них не удавалось, и инфекция далее не передавалась следующей партии контактно подсаженных птиц.

Индикация выделенного вируса. Вирус EDS-76, как правило, типируют в РЗГА и РН на утиных эмбрионах или в культуре клеток утиного происхождения. Учитывая, что между шт. вируса EDS-76, выделенными в различных странах, отсутствует антигенное различие, в качестве специфических сывороток для типирования вновь выделенного вируса используют антисыворотки к штаммам 127, ВС-14, Е-7, В8/78, 3877 и JPA-1.

Антисыворотку к штаммам готовят на SPF-курах-несушках и кроликах и используют для непрямого метода иммунофлюоресценции с меченой кроличьей или козьей антикуриной сывороткой конъюгированной ФИТЦ.

Первые изменения в инфицированной культуре клеток утиньк фибробластов отмечают уже через 48 ч после заражения, когда в пограничных районах, зонах клеточного монослоя, появляются отчетливые и частые уплотнения. Через 72 ч после заражения появляется множество округлившихся клеток и мертвых клеток, плавающих в среде; монослой начинает сжиматься и в нем появляются большие дыры. К 96-му часу монослой зараженных клеток, содержащих соединившиеся гранулы, формирует длинные тяжи. Таким изменениям подвергаются эпителиальные клетки. Однако фибробласты между эпителиальными островками не поражены. Часто в среде культивирования присутствует большое число округлых, свободно плавающих клеток. В этом, собственно, и состоит цитопатический эффект, индуцируемый шт. 127.

Окраска зараженного монослоя гематоксилин-эозином позволяет выявлять внутриядерные включения.

ЭМ. Через 24 ч после заражения культуры клеток утиных фибробластов вирионы и несколько типов включений выявляются в ядрах клеток. Размер частиц составлял 70-75 нм в диаметре. Отмечали 2 основных типа их. Некоторые из них имели электронноплотную сердцевину (нуклеотид) 50 нм в диаметре, отделенную от внешнего капсида светлым пространством. Другие частицы имели электронно-светящийся (яркий, прозрачный) центр, содержащийся в мембране, соединенной с капсидом. Эта внутренняя структура (40 нм) была также отделена светлым пространством от внешнего капсида.

Серодиагностика. Помимо выделения и идентификации вируса с помощью РГА-РЗГА и ИФ у птиц подозрительного стада исследуют сыворотки на присутствие специфических антител. Это делается в 3-х случаях: когда изучают динамику AT в результате экспериментального заражения птицы: при широких полевых серологических обследованиях птицы с целью установления наличия инфекции в стаде, используя принцип парных сывороток; и в случаях установления иммунологического статуса птицы после применения вакцины. Во всех случаях применяют серологические исследования (РЗГА, РДП, РН и ИФА), для чего врачу-диагносту необходимо в качестве контроля иметь под рукой заведомо положительные сыворотки. Тест ингибиции ГА (РЗГА) с желтком яиц. Предложен в 1985 г. Он имеет ряд преимуществ перед аналогичной РЗГА с испытуемой сывороткой крови.

РН. Её ставят в утиных эмбрионах и в культурах клеток печени и почки эмбрионов уток и утиных фибробластов и имеет важное значение для типирования вируса в сомнительных случаях. Для этого монослойную культуру, выращенную в пробирках на среде Игла, инокулируют смесью вирус-сыворотка, которую предварительно выдерживают (30 мин) при комнатной температуре (22°С ) и инокулируют по 0,2 мл в 5 пробирок с культурой клеток. Данная реакция может быть использована для определения различий между типичными аденовирусами птиц, поскольку этот метод недостаточно чувствителен для обнаружения сходных антигенов. С помощью РДП проводят серологическое исследование стада кур на EDS-76, но она менее чувствительна, чем РЗГА, и в РДП невозможно обнаружить низкий уровень AT. РДП удобно ставить и с экстрактом желтка.

На основании сравнительных исследований по обнаружению AT к вирусу ССЯ-76 в РЗГА и ИФА была установлена более высокая чувствительность последнего. Он выявлял положительных сывороток на 7% больше, чем РЗГА.

Дата добавления: 2014-03-03; просмотров: 443; Нарушение авторских прав

Мы поможем в написании ваших работ!