Методы количественного определения холестерина

в сыворотке крови. Клинико-диагностическое значение*

Холестерин (ХС) является важным липидным компонентом всех тканей и клеток организма. 80% ХС в организме составляет свободный ХС, почти весь он является компонентом биологических мембран. В то же вре­мя в сыворотке (плазме) крови 2/3 ХС представле­но в форме эфиров холестерина. Больше всего его в надпочечниках, крови, нервной системе, коже, пищеварительном аппарате. Основным местом биосинтеза ХС явля­ется печень. В организме человека с массой тела 70 кг содержится в среднем 140 г ХС, т. е. около 0,2% массы тела. Известно, что человек с пищей полу­чает в среднем 0,4-0,5 г ХС в день, синтезирует же ежедневно в организме в количестве 1,5-4,2 г, в среднем 2 г. Таким образом, большая часть ХС ор­ганизма образуется эндогенно.

В настоящее время применяют референсные границы содержания ХС, установленные ВОЗ. Согласно этим данным верхний уровень нормаль­ного содержания ХС в возрасте 20-29 лет состав­ляет 5,17 ммоль/л, 30-39 лет - 5,69 ммоль/л и бо­лее 40 лет - 6,21 ммоль/л. На уровень ХС оказы­вает влияние характер пищи и прием алкоголя, ин­тенсивные физические тренировки, фармакологи­ческие препараты, включая гормональные контра­цептивы, стероиды, гиполипидемические препара­ты. Сезонные и дневные вариации не оказывают влияния на уровень ХС в сыворотке крови.

Содержание ХС в крови является важным диаг­ностическим тестом. Уменьшение концентрации ХС (гипохолестеринемия) обнаружено при гипертиреозе, анемиях, туберкулезе, лихорадочных со­стояниях, голодании, паренхиматозной желтухе, поражении центральной нервной системы, онко­логических заболеваниях. Количество ХС в крови может увеличиваться при нарушении переноса и поглощения клетками липидов. Длительная гиперхолестеринемия является тестом развития атеро­склероза вследствие отложения в стенке артерий преимущественно ЭХС с последующим образова­нием атеросклеротических бляшек. Резко повыша­ется содержание ХС в органах при жировой ин­фильтрации. Увеличение концентрации ХС отме­чается также при механической желтухе, гломерулонефрите и нефротическом синдроме, сопровож­даемых отеками, сифилисе, гипотиреозе, В-авитаминозе и т. д. Очень высокий уровень ХС в крови наблюдается при сахарном диабете и липоидном гидронефрите - 26,86

ммоль/л и выше.

Определение содержания ХС не дает ди­агностической информации о конкретном заболе­вании, а характеризует общую патологию обмена липидов. Определение ХС имеет социальное зна­чение, так как повышенный уровень ХС в популяции требует организационных мероприятий по первичной профилактике коронарного атеро­склероза.

Гиперхолестеринемия является независимым фактором риска ИБС. Связь между уровнем общего ХС плазмы крови и смертностью от ИБС является весьма жесткой и описывается экспоненциальной кривой. Холестерин ЛПВП как "предсказатель" ИБС оказался в 8 раз чувствитель­нее, чем холестерин ЛПНП. Предложено в качестве "предсказателя" рассчитывать так называемый холестериновый коэффициент атерогенности (К), представляющий собой отношение холестерина ЛПНП и ЛПОНП к холестерину ЛПВП:

холестерин ЛПНП + холестерин ЛПОНП

холестерин ЛПВП

В клинике очень удобно рассчитывать этот коэффициент на основании определения общего холестерина и холестерина ЛПВП:

общий холестерин - холестерин ЛПВП

холестерин ЛПВП

Чем выше этот коэффициент (у здоровых лиц он не превышает 3), тем выше опасность развития (и наличия) ИБС.

Методы определения ХС можно классифициро­вать следующим образом: а) химические; б) ферментные; в) электрохимические; г) хроматографические.

К химическим относятся методы определения продуктов взаимодействия ХС с кислотами Льюиса после его дегидроксилирования. В качестве реагентов наиболее часто применяются либо реактив Либермана-Бурхарда (смесь концентрированной H₂SO₄, СН₃СООН и уксусного ангидрида), ли­бо реактив Златкиса-Зака (H₂SO₄ и соли Fe³⁺). Известно большое число модификаций этих методов, отличающихся способами пробоподготовки, соотношением реактивов и условиями про­ведения реакций. В зависимости от способа подготовки пробы хи­мические методы можно разделить на 2 группы: 1) прямые методы, не предусматривающие предварительную подготовку пробы;

2) экстракционные методы, включающие экс­тракцию ХС органическими растворителями.

Основным достоинством прямых методов является простота, доступность и низкая стоимость анализа. Важнейшим недостатком является неспецифичность. Это связано с тем, что в жестких условиях, учитывая значительное эндогенное образование тепла, в реакцию вступают многие компоненты сы­воротки крови, образуя окрашенные

продукты (ча­ще всего в результате дегидратации). На определение ХС сильно влияют билирубин, гемоглобин, каротин, неко­торые стеролы, лекарственные препараты, присут­ствующие в крови. Причиной ошибки может яв­ляться также денатурация белка сыворотки в при­сутствии кислоты. Из-за влияния этих факторов результаты определения ХС прямыми методами оказываются завышенными в среднем на 2—12%.

. Включение этапа экстракции повы­шает специфичность метода; результаты определе­ния ХС в среднем на 7% ниже, чем при прямом ме­тоде. Спектр используемых экстрагентов довольно широк. В на­стоящее время наиболее часто применяются гексан, изопропанол, петролейный эфир,смесь метанол-хлороформ. Приме­няемые растворители достаточно эффективно отде­ляют ХС от основных интерферирующих веществ: билирубина, гемоглобина и других белков, многих лекарств, однако холестериноподобные стерины экстрагируются вместе с ХС.

В химических методах обычно используют фотометрическую регист­рацию (λmax = 560 нм), однако для повышения чув­ствительности применяют и флуориметрический способ. При этом снижается влияние

ряда мешающих компонентов.

Ферментные методы. В настоящее время 95% лабораторий мира использует ферментный способ определения ХС. Ферментное определение протекает в несколько этапов:

I стадия - ферментный гидролиз эфиров ХС (чаще всего используют холестеринэстеразу):

Холестеринэстераза

Эфиры ХС + Н₂О -------------------------------► ХС + ЖК (1)

II стадия - окисление ХС растворенным в ре­акционной смеси кислородом воздуха в присутст­вии оксидазы ХС:

Холестериноксидаза

ХС + О₂ --------------------------------► Холест-4-ен-З-он + Н₂О₂ (2)

III стадия - определение продуктов реакции (Н₂О₂ или холест-4-ен-З-она) или убыли кислорода в процессе ее протекания. Чаще всего содержание ХС находят, определяя Н₂О₂, образующийся в ходе реакции (2).

Электрохимическое определение холестерина. Электрохимические варианты ферментного метода определения ХС основаны на регистрации уменьшения парциального давления О₂ или на увеличении концентрации Н₂О₂ в ходе реакции (2).

Хроматографические методы. Методы высокоэффективной жидкостной хроматографии и газожидкостной хроматографии обладают высокой разрешающей способностью при разделении близких по свойствам стеринов, позволяют проводить определение в малых количествах биологического материала (капиллярная кровь).

Лабораторная работа №12

Дата добавления: 2015-07-26; просмотров: 742; Нарушение авторских прав

Мы поможем в написании ваших работ!