ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ И ОСНОВНЫЕ ПОНЯТИЯ ГЕННОЙ ТЕРАПИИ

Основные понятия.

Генотерапия.

ВВЕДЕНИЕ. Проблемы генотерапии наследственных и мультифакториальных болезней на современном этапе решаются в сфере молекулярной медицины, которая рассматривает проблемы здоровья и болезней человека на уровне функции нуклеиновых кислот. Основные разделы молекулярной медицины - это молекулярная диагностика, привентивная (профилактическая) медицина и генная терапия.

Согласно современным представлениям генную терапию (ГТ) понимают как введение нуклеиновых кислот в клетку с целью воздействия на медицинский статус организма и/или лечения болезни. При этом сам ген уже воспринимается как новый фармацевтический препарат для лечения многих заболеваний, не только моногенных, но и полигенных, мультифакториальных и других патологических состояний. Если к этому добавить безусловную перспективность генов и их ДНК-фрагментов в создании нового поколения вакцин против многих инфекционных болезней и даже опухолей, то потенциальные возможности ГТ представляются безграничными! Предполагается, что на современном этапе развития молекулярной медицины, фармакология может пополнится 60-70 тысячами новых генно-инженерных препаратов! Поэтому ведущие фармацевтические фирмы мира, особенно США, не скупятся на вложении сотен млн. долларов в разработку сотен проектов генотерапии. Следует отметить, что из нескольких сотен проектов около 66% еще находятся на фазе I клинических испытаний (оценка токсичности генной конструкции), около 33% - между фазами I/II (ограниченные испытания на небольшом контингенте больных) и только 2 проекта, касающиеся лечения смертельной опухоли мозга - глиобластомы - на фазе III (широкомасштабные клинические испытания в нескольких центрах). Естественно, что среди выполняемых проектов ГТ более 60% приходится на лечение опухолей, примерно по 15% на лечение инфекционных болезней (СПИД, гепатит В, туберкулез и др.), столько же на лечение моногенных заболеваний (муковисцидоз, болезни накопления (мукополисахаридозы), семейная гиперхолестеринемия, гемофилия В и др.). Остальные эксперименты касаются, главным образом, изучения возможностей использования генных конструкций с целью клеточного маркирования в опытах in vivo. Такие эксперименты были начаты еще в 1989г. и позволили получить важную информацию об иммунологических свойствах опухолевых клеток и их чувствительности к Т-лимфоцитам.

В целом история ГТ как нового направления медицины может быть разделена на три этапа. Этап I - (1970-1990) характеризуется попытками лечения дефицита фермента аргиназы заражением клеток вирусом папилломы Шоупа. В это же время предпринята неудачная попытка лечения бета-таллассемии пересадкой клеток костного мозга, трансформированных ex vivo бета- глобиновым геном; генетическое маркирование Т-лимфоцитов. Начало этапа II знаменуется единственной до настоящего времени успешной попыткой лечения врожденного иммунодефицита, осуществленной в США в сентябре 1990 г. В 1992 г. предприняты попытки лечения методом ex vivo семейной гиперхолестеринемии (мутация в гене рецептора липопротеинов низкой плотности) и гемофилии В, в 1993 г. - муковисцидоза и в 1995 г. - первые попытки лечения глиобластомы. Эти исследования по ГТ и попытки клинических испытаний до 1996 г. все еще оставались единичными. С 1997 г. и по настоящее время (этап III), когда наметился качественный прорыв в технике доставки чужеродных генов и, как казалось многим, появились реальные шансы быстрого терапевтического эффекта при самых разных заболеваниях,) число проектов, одобренных в США Комитетом RAC (Recombinant Advisory Committee) увеличилось до 200 и продолжает стремительно возрастать, достигнув к концу 1999г уже 400.

Вместе с тем, по справедливому замечанию одного из пионеров ГТ американского исследователя Фрэнча Андерсона " За исключением нескольких непроверенных случаев ни один из протоколов ГТ пока не оказался успешным в лечении болезней человека ".Краткий анализ результатов ГТ на сегодняшний день позволяет прийти к следующим основным выводам: 1) ГТ пригодна для лечения широкого спектра заболеваний; 2) ГТ- в применяемом объеме имеет низкий риск осложнений; 3) Эффективность ГТ пока весьма разочаровывает.

В чем же основная причина таких неудач? Главное - до сих пор практически ни в одном проекте ГТ не удалось получить успешной трансформации (трансдукции) достаточно большого числа клеток-мишеней и добиться терапевтически значимой длительности экспрессии чужеродного гена.

ПРОБЛЕМА ВЕКТОРОВ - ОСНОВНАЯ ПРОБЛЕМА ГЕННОЙ ТЕРАПИИ

Проблема доставки нужного гена в нужную клетку с целью получения правильной дозы необходимого белкового продукта, обладающего терапевтическим эффектом, до настоящего времени не решена и по сути, продолжает оставаться центральной проблемой ГТ проектов.

Трудность достижения этой цели по образному выражению Фрэнча Андерсона определяется тем, что "организм человека затратил много тысяч лет, чтоб защитить себя от нападения факторов вненешней среды, в т.ч. от чужеродной ДНК, пытавшейся проникнуть в его геном". Естественно, что преодолеть эти барьеры оказывается очень сложно. Не случайно технология доставки генов является главным препятствием на пути успеха ГТ.Для решения этой проблемы в настоящее время существуют самые разные методы (физические, химические, биологические). Рассмотрим основные из них, которые активно совершенствуются и представляются наиболее перспективными на сегодняшний день.

1) Хорошо известно, что наиболее популярными в проектах ГТ до настоящего времени являются векторы на основе вирусов и липидов (липосом). При этом из 396 ГТ проектов на сентябрь 1999г. в более 40% используют различные варианты ретровирусов (РВ), в 20% - модифицированные аденовирусы (АВ), в 20% липосомы (Л). В остальных 20% проектов применяют, адено-ассоциированный вирус (ААВ), вирус оспы, генное ружье (ГР) и даже "голую" ДНК. Каждый из векторных систем имеют свои преимущества и недостатки.

Учитывая, что основным недостатком АВ был выраженный иммунный ответ организма на введение АВ конструкций, прогресс в этой области коснулся создания АВ векторов, лишенных практически всех собственных генов АВ (gutted AdV vectors) и АВ, с резко ослабленным антигенными свойствами, провоцирующим иммунный ответ. Последние по аналогии с военным самолетом-невидимкой получили название Стелс ( Stealths AdV). Естественно, что удаление собственных генов АВ позволило резко увеличить размеры переносимых генных конструкций, однако, и создало дополнительные сложности с наработкой и очисткой таких векторов.

В связи с тем, что ретровирусы успешно инфицируют только митотически делящиеся клетки, заметно повысился интерес к другим вирусам, таким как ленти-вирусы и особенно адено-ассоциированные вирусы, которые хорошо проникают и в неделящиеся клетки .

Большое внимание в последние годы уделяется разработке комбинированных векторов с адресной доставкой, совмещающих преимущества вирусных и невирусных носителей. В частности, особенно активно изучаются комбинации АВ + полилизин + белок (асиалогликопротеин для рецепторов клеток печени, трансферрин (мышечные фибриллы), Fab-полилизин (эпителий бронхов, кишечника). Весьма перспективным представляется использование не самих вирусов, а только отдельных пептидов их оболочки, контролирующих процесс проникновения в клетку и интернализацию в ядро. Некоторые вирусные олигопептиды использованы в экспериментах по ГТ миодистрофии Дюшенна (см. ниже).

В качестве перспективных векторов на сегодняшний день рассматриваются синтетические полимеры типа полиэтиленоксид - полиэтилэтилен, а так же биологические полимеры типа декстрана, желатина, образующие при определенных условиях упаковки микросферы, называемые так же полимеросомы. Размеры таких микросфер можно регулировать в зависимости от условий упаковки. Кроме того, их неограниченные возможности в отношении размеров плазмидной ДНК, растворимость в живых тканях (биодеградируемость) и выраженная способность к проникновению внутрь клеток и даже в ядра (см. ниже) привлекают к полимеросомам все больше специалистов по ГТ. Один из вариантов таких полимеросом оказался особенно перспективным для ГТ миодистрофии Дюшенна (см. ниже). Другой биологический полимер - ателоколлаген - с успехом применен в создании депо для экспрессирующихся генных конструкций в скелетных мышах.

Дата добавления: 2014-03-21; просмотров: 427; Нарушение авторских прав

Мы поможем в написании ваших работ!