Лекция 3. Метод замороженных срезов (крио-микроскопия)

Метод замороженных срезов (крио-микроскопия)

В основе крио-методов лежит быстрое замораживание образцов, предотвращающее образование кристаллов льда и, соответственно, повреждение ими клеток. Витрификация воды осуществляется помещением образца в жидкий этан, или на охлажденный металлический блок. Дорогой современный вариант – замораживание при высоком давлении.

Метод замороженных срезов, когда режутся нефиксированные образцы, применяется достаточно широко в клинической практике для экстренной диагностики, и в различных научных исследованиях, - аналог парафиновых срезов. Для диагностики достоинством метода является быстрота приготовления срезов и возможность изучения тканей и клеток без предварительной фиксации и проводки. Необходимым условием использования этого метода является наличие криостата или замораживающего микротома. В криостате пониженная температура создается внутри всей камеры, а в замораживающем микротоме на нож и образец подается твердая углекислота.

Образцы обычно замораживают жидким азотом, затем в криостате готовят срезы. Кусочки укрепляют на держателе с помощью воды, иногда образец также погружают в воду и режут вместе со льдом, подобно парафиновому блоку. Срезы монтируют на стекло, затем обрабатывают в зависимости от задач исследования. Для рутинной диагностики срезы быстро фиксируют формалином, окрашивают и просматривают в микроскопе.

Спектр использования метода замороженных срезов очень широк. Гистохимия ферментов – одно из направлений. Оттаявшие срезы переносят в термостат, где и проводится реакция. Данный метод используют для выявления разных ферментов, активность которых не сохраняется при фиксации, в частности, различных дегидрогеназ. При работе этих ферментов генерируются электроны или протоны, которые связываются с акцептором-красителем. Краситель меняет цвет, окрашивая структуры, где локализован данный фермент. Наиболее распространены красители группы нитро-синего тетразолия, которые из желтых становятся синими или темно-фиолетовыми. Например, таким образом можно изучать уровень активности того или иного фермента в клетках при разных функциональных состояниях. Сукцинатдегидрогеназа – один из ферментов цикла Кребса.

Иммуногистохимия

Иммуногистохимия – выявление белков (антигенов) в тканях и клетках с помощью меченых антител. В настоящее время выделяется два основных направления иммуногистохимии: с использованием парафиновых и замороженных срезов. Несмотря на один и тот же основной принцип (реакция антиген-антитело), существует множество нюансов в использовании того или иного метода, и фирмы-производители выпускают антитела с пометкой «для парафиновых срезов», или – «для замороженных».

Иммуногистохимические методы в настоящее время очень широко распространены и используются не только в научной работе, но и в медицинской диагностике. Основной реактив, общий для всех иммуногистохимических методов - антитело. Способность специфических антител связываться с тканевыми белками обеспечивает возможность выявления этих белков в клетках и тканях. Суть любой иммуногистохимической реакции состоит в визуализации комплекса антиген-антитело.

Дата добавления: 2014-03-03; просмотров: 398; Нарушение авторских прав

Мы поможем в написании ваших работ!