Электронная микроскопия биологических объектов

Попытки рассмотреть в электронном микроскопе биологические объекты натолкнулись на ряд трудностей, для преодоления которых пришлось разрабатывать новые методы обработки биологических образцов. Живые клетки с помощью электронного микроскопа не исследуются. Очевидная причина - достаточно высокий вакуум в колонне, живые клетки, содержащие значительное количество воды, мгновенно повреждаются и гибнут при помещении их в вакуум и при облучении интенсивным потоком электронов.

Требования к образцу для электронно-микроскопического исследования: оптимальная толщина, неоднородность химического состава и присутствие тяжелых элементов; устойчивость к воздействию вакуума, температуры и электронного луча.

Особенности биологических объектов, определяющие характер подготовки материала для электронно-микроскопического исследования.

Химический состав биологических объектов. Сохранение структуры с помощью стабилизации химических связей (фиксация).

Способы соблюдения требования оптимальной толщины. Опорные пленки. Ультратонкие срезы.

Способы повышения контраста изображения (контрастирование солями тяжелых металлов, напыление). Изучение макромолекул с использованием метода напыления (оттенения) металлами (платина, палладий, золото). Недостатки метода: дает информацию только о внешнем виде объекта, увеличивает размеры объекта на толщину напыленного слоя (1—15 А).

Изучение нуклеиновых кислот методом напыления. Гетеродуплексный анализ.

Метод негативного контрастирования. Уранилацетат, фосфорно-вольфрамовая кислота. Области применения (быстрая диагностика (идентификация) вирусов, изучение вирусных суспензий, определение концентрации вирионов в суспензии (физический титр). Индикация бактериальных клеток. Достоинства метода: позволяет изучить форму и размеры вирусных частиц; изучить строение поверхности вирусных и частиц и бактериальных клеток.

Требования к препаратам: концентрация не ниже 10 ⁶ - 10 ⁷ частиц в мл; чистота.

Основные этапы исследования методом негативного контрастирования:

подготовка сеточек с подложкой; нанесение суспензии вируса (бактерий) на сеточку, экспозиция; экспозиция сеточки с контрастирующим веществом (уранилацетат, фосфорно-вольфрамовая кислота и др.); просмотр сеточки в электронном микроскопе.

Формирование изображения при негативном и позитивном контрастировании.

Метод криофрактографии (криоскалывание). Особенность метода – приготовление препаратов без химической фиксации. Этапы приготовления образцов (реплик): замораживание жидким азотом, приготовление скола и возгонка воды в вакууме, напыление углеродом и металлом, обработка кислотой. Этот метод сыграл важную роль в электронно-микроскопическом изучении клетки и в понимании её строения. Именно с помощью криофрактографии было показано, что альдегидная фиксация обеспечивает адекватное, соответствующее нативной (замороженной) клетке, сохранение клеточных структур.

Дата добавления: 2014-04-24; просмотров: 710; Нарушение авторских прав

Мы поможем в написании ваших работ!