Аудиторная работа. Лабораторная работа (количественное определение

Лабораторная работа (количественное определение

пировиноградной кислоты – видоизмененный метод Умбрайта).

Содержание пировиноградной кислоты /ПК/ в крови и тканях может изменяться при некоторых патологических состояниях – кислородной недостаточности, дефиците витамина В₁ и других.

Определение ПК в крови основано на том, что она при взаимодействии с 2,4-динитрофенилгидразином образует 2,4-динитрофенилгидразон - соединение желтого цвета. При добавлении спиртового раствора щелочи к толуоловому экстракту, содержащему это соединение, развивается оранжево-красное окрашивание, интенсивность которого пропорциональна содержанию ПК. Определяя оптическую плотность раствора, можно рассчитать содержание ПК с помощью калибровочного графика.

Ход работы. 1. Приготовить безбелковый фильтрат крови: в пробирку внести 2 мл 10% раствора трихлоруксусной кислоты и затем 0.4 мл крови, смешать и после 10-минутной экспозиции фильтровать через бумажный фильтр. 2. В сухую пробирку внести 1 мл фильтрата, добавить 0.5 мл 0.1% раствора солянокислого раствора 2,4-динитрофенилгидразина и через 5 мин прилить 2,5 мл водонасыщенного толуола. Энергично встряхивать 2 мин и оставить до расслоения. Из толуолового (верхнего) слоя отобрать 1 мл и перенести в сухую пробирку. Прилить 2 мл спиртового раствора щелочи.

Одновременно проводится контрольная проба – в неё вместо фильтрата крови вносится дистиллированная вода.

Оптическую плотность полученного в опыте раствора колориметрировать против контрольной пробы (кювета 5 мм, фильтр синий). По результатам определения оптической плотности устанавливают содержание ПК, учитывая, что 1 мл крови соответствует 0,2 мл безбелкового фильтрата.

Для построения калибровочной кривой вносят в последовательно пронумерованные пробирки 0.2, 0.4, 0.6, 0,8 и 1.0 мл стандартного раствора ПК, доводят каждую пробирку водой до 1 мл и проводят те же операции, что в опыте. При построении кривой откладывают на оси абсцисс количества ПК в исследуемом ряду пробирок, а на оси ординат найденные значения оптической плотности.

Проконтролируйте освоение материала, решая контрольные задачи:

1. Молочная кислота в защищенной от доступа кислорода биологической системе образуется со скоростью 0,1 мкмоля/ч. Единственный субстрат окисления – глюкоза.

Рассчитать расход глюкозы.

2. Подсчитать энергетический эффект анаэробного гликолиза: субстрат – гликоген, скорость образования лактата – 0,05 мкмолей в час на 1 г ткани.

3. Что происходит с восстановленной формой НАД (НАД.Н+), если в системе окисления глюкозы имеется доступ кислорода (т.е. ПК не восстанавливается).

4. Объясните, почему интенсивность анаэробного гликолиза высокая в первые минуты мышечной работы.

5. Объясните возможные механизмы развития патологии зубов и периодонта под влиянием микрофлоры зубных отложений.

Дата добавления: 2014-10-14; просмотров: 579; Нарушение авторских прав

Мы поможем в написании ваших работ!