Индикация и идентификация вируса. Вирусоскопия, электронная и иммуноэлектронная микроскопия

Вирусоскопия, электронная и иммуноэлектронная микроскопия. Разработан точеч­ный иммуноблотинг для обнаружения с помощью 2-х монАТ вируса ИБ в материалах из за­раженных клеточных культур и в образцах ткани селезенки кур. Предел чувствительности монАТ, как иммунологических зондов, составлял 48 нг АГ. МонАТ выявляли присутствие вирусного АГ в тканях бурсы и селезенки через 2 сут после заражения. Дот-блотгибридизацией вирусспецифической РНК вирусспецифический АГ выявлялся уже спустя сутки после заражения. Этот метод более чувствителен, чем методы ИФ и РДП.

ИФ. Рекомендуется как дополнительный метод экспресс-диагностики, так как позволяет установить диагноз в течение 2-3 ч с момента доставки патматериала. С этой целью приме­няют прямой и непрямой варианты ИФ. Для ИФ из ткани фабрициевой сумки больной или павшей птицы готовят тонкие мазки-отпечатки (не менее трех) на обезжиренных предмет­ных стеклах, высушивают на воздухе, фиксируют 10-20 мин в ацетоне, дважды отмывают в 2-х сменах 0,01 М фосфатно-буферного р-ра, приготовленного на 0,15 М р-ре NaCl (pH 7,2-7,4), затем снова высушивают при комнатной температуре и окрашивают общеприня­тым методом. В качестве контроля используют препараты, приготовленные из фабрициевой сумки здоровых цыплят и аналогично обработанные. Диагноз считают положительным, ес­ли во всех 3-х препаратах обнаружено не менее 2-3 клеток со специфическим ярко-зеленым свечением АГ в цитоплазме (мелкие гранулы или диффузный ореол вокруг ядра). Ядерного свечения нет. Интенсивность и форма свечения вирусного АГ в клетке зависят от стадии развития болезни. АГ выявлялся через 24 ч после инфицирования, значительное возрастание интенсивности свечения обнаружено с 3-го по 10-й день после заражения, а на 11-12-й день количество флюоресцирующих клеток уже снижа­лось, и на 13-й день они полностью отсутствовали. Помимо фабрициевой сумки специфиче­ская ИФ отмечалась в цитоплазме лимфоидных клеток с 3-го по 5-й день после заражения. Из гл. мозга, тимуса, легких, сердца, печени, почек и миндалин слепых отростков кишечника экспериментально зараженной птицы не удалось обнаружить АГ.

РН.Это основной тест для идентификации вируса ИБ. В ней используют специфиче­скую гипериммунную к вирусу и нормальную сыворотку, а в качестве АГ - выделенный на КЭ вирус. Перед постановкой реакции сыворотки инактивируют 30 мин при 58°С. РН ставят по общепринятой методике по варианту: постоянная доза сыворотки и различные разведе­ния вируса. Гипериммунную и нормальную сыворотки разливают по 0,5 мл в стерильные пробирки. Затем в каждую из них добавляют по 0,5 мл вируса в разведении 10'⁵. Штатив с пробирками встряхивают и выдерживают при 37°С 30 мин или при 4°С 18-20 ч. По­лученные смеси в дозе 0,2 мл вводят в аллантоисную полость 4-, 6- и 9 дн эмбрионов, кото­рые затем инкубируют при 37°С. Дважды в день их овоскопируют и павших (после охлаж­дения) вскрывают На 10-й день инкубации все эмбрионы вскрывают для выявления специ­фических изменений. Результаты выражают индексом нейтрализации (ИН), который опре­деляют по общепринятой методике.

РДП. Широко применяют как с целью индикации и идентификации вируса, так и для обнаружения AT. Реакция специфична, может проводиться в более ранние сроки, начиная с 8-го дня болезни. Предложен быстрый (в течение 45 мин) метод обнаружения в РДП спе­цифических AT в сыворотках крови птиц. В качестве АГ могут быть использованы фабрициевы сумки зараженных цыплят Считают, что концентрация преципитиногенов и положи­тельно реагирующих проб значительно больше при использовании фабрициевых сумок, взя­тых через 3-4 дня после заражения цыплят. ХАО КЭ не пригодны для диагностики ИБ в РДП, т.к. не обладают преципитирующими свойствами. РДП ставят по общепринятой мето­дике на предметных стеклах или в чашках Петри в 1%-м агаровом геле. Реакцию учи­тывают через 24-48 ч инкубирования при комнатной температуре. Чувствительность РДП связана с применением 0,01 М трис-HCl буфера (рН 7,3), АГ в исходной концентрации и иммунной сыворотки в рабочем разведении. Для ретроспективной диагностики исследуют в РДП сыворотки крови от суточных цыплят или от птиц старше 3-х мес.

РНГА. Оказалась пригодной для диагностики ранней инфекции, а РТНГА - для индика­ции и идентификации вируса ИБ, выделенного на КЭ. Установлено, что сывороточные AT, агглютинирующие сенсибилизированные эритроциты, выявляются у отдельных птиц уже на 3-5-й день после заражения в титрах 1:8-1:16, а к 2-3 нед после заражения - у 25-70% птиц в титрах 1:16-1:32. Титр AT нарастал до 3-4-й нед, затем снижался до 1:2-1:4.

Дата добавления: 2014-03-03; просмотров: 361; Нарушение авторских прав

Мы поможем в написании ваших работ!