МЕРОПРИЯТИЯ В СТАДАХ НЕБЛАГОПОЛУЧНЫХ ПО ЭНЗООТИЧЕСКОМУ ЛЕЙКОЗУ КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА

25. По результатам серологических исследований инфицированных животных вместе с приплодом изолируют и в течение 7 дней, независимо от сроков стельности и возраста, сдают на убой под надзором ветеринарных врачей. Проводят эпидемиологическую служебную проверку. Животных, показавших отрицательный - результат, подвергают серологическим исследованиям через 4 месяца.

.26.молоко от инфицированных коров используют животным группы откорма после обезвреживания (кипячение). Молоко от животных давших отрицательные результаты используют на общих основаниях. В случае, если зараженные ВЛКРС животные не изолированы, то до сдачи их на убой молоко от всего стада подлежит пастеризации в хозяйстве при температуре 76°С в течение 30 сек.

27.27. В случае выявления клинических признаков болезни у животного молоко подлежит утилизации, а животное - немедленной сдачи на убой. Быки-производители с положительной реакцией при исследовании на
лейкоз подлежат немедленному убою, а запасы спермы, полученные от них за последние 6 месяцев, уничтожаются.

31, Стадо, получившее два отрицательных результата с интервалом в 4

месяца у животных с 24 месячного возраста приобретает статус

оздоровленного.

32.В стадах, оздоровленных по энзоотическому лейкозу, животных в

возрасте от 24-х месяцев, подвергают серологическим исследованиям один

раз в год в течение двух лет, при получении отрицательных результатов стадо официально признается свободным от энзоотического лейкоза.

Основной метод прижизненной диагностики лейкоза —серологический, проводится с помощью реакций ИФА, РИД, для выявления специфических АТ к АГ ВЛКРС(вируса лейкоза КРС).

Наставление по применению набора для диагностики лейкоза крупного рогатого Скота в реакции иммунодиффузии (РИД)

Набор для диагностики лейкоза крупного рогатого скота в реакции иммунодиффузии (РИД) предназначен для массовых исследований сывороток крови с целью выявления животных, инфицированных вирусом лейкоза (ВЯ). Порядок применения набора

Перед постановкой реакции содержимое 1 флакона разбавителя антигена добавляют во флакон с антигеном ВЛ.который при перемешивании должен раствориться с образованием опалесцирующей жидкости красно-малинового цвета.

2.2Для приготовления геля агара солевую смесь агара (ССА), содержащуюся в двух флаконах переносят в стеклянную колбу вместимостью 250-300 мл, добавляют содержимое 2 флаконов с разбавителем ССА и 180мл дистиллированной воды. Колбу закрывают ватно-марлевой пробкой, ставят в баню с водой, воду доводят до кипения и выдерживают до полного расплавления агара. На строго горизонтальную поверхность лабораторного стола помещают необходимое количество чашек Петри диаметром 100мм, предварительно обезжиренных этиловым спиртом, в которые вносят по 12,5 мл расплавленного агара. Чашки оставляют течение часа с приоткрытыми крышками. С помощью штампа делают отверстие (лунки) в геле. В каждой чашке прорезают 5 фигур каждая из которых состоит из 7 лунок(одна лунка в центре, остальное 6 по периферии). Диаметр лунок -7 мм, расстояние между центральной и периферическими лунками - 3 мм 2.3. Антиген ВЛ вносят в центральную лунку, положительную контрольную сыворотку (ПКС), закапывают в две диаметрально противоположные периферические лунки каждой фигуры. В остальные лунки вносят исследуемые сыворотки крови.

Каждый компонент реакции вносят отдельной пипеткой. Объем вносимого компонента определяют по мениску жидкости в лунке с уровнем геля агара.

2.4. Чашки закрывают крышками и оставляют при температуре +20- +26°С на 48 часов.

СЛЕДУЙЩИЙ ДЕНЬ

3. Учёт и интерпретация результатов.

3.1. Учет реакции проводят в затемненной комнате, просматривая чашки в проходящем под углом луче света осветителя ОИ-19.

3.2. Реакцию оценивают только в том случае, если в геле агара между лунками с ПКС и антигеном ВЛ сформирована четкая линия преципитации.

3.3. При наличие антител к ВЛКРС в испытуемой сыворотке крови контрольная линия преципитации, не доходя до края лунки, образует изгиб, плавно и четко соединяется с линией преципитации между антигеном ВЛ и испытуемой сывороткой. Такую реакцию оценивают, как положительную, а животное считают инфицированным вирусом лейкоза.

При слабоположительной реакции отмечается только незначительный загиб контрольной линии преципитации в сторону испытуемой сыворотки.

Инструкция
ИФА по сыворотке крови
(Скрининг)

Принцип метода: АГ ВЛКРС, иммобилизированный на поверхности лунок полистероловой микропанели с помощью специфических моноклональных АТ, связывается с АТ, присутствующими в иссл материале, формируя приэтом комплекс АГ-АТ.Полученный иммунный комплекс выявляется после взаимодействия с антивидовым конъюгатом (моноклональные АТ к АГ ВЛКРС, меченные пероксидазой), фермент которого после добавления субстрата, вызывает разложение субстрат-индикаторного раствора и образование окрашенного продукта. При этом интенсивность окрашивания в лунке микропанели пропорциональна содержанию ВЛКРС-специфических АТ в иссл пробе.

Для иссл в лабораторию доставляют индивидуальные сыворотки крови КРС в количестве 5-6 мл с сопроводительными документами, в которых указывают название района, хозяйства, номер, пол, возраст животного. Сыворотку можно хранить: при температуре +4С не более 6-ти суток или при температуре -20С в течении 40-60сут.

Индекс чувствительности: объединяется до 10 сывороток, объединение производят на пластиковых микропанелях по 30 мкл от каждой исследуемой пробы.

1.Растворяем 20% концентрат промывочного раствора 100мл-1900 мл. дистиллированной воде.

2.Во все используемые лунки микропанели вносим по 190 мкл. буфера - 2 заливаем в каждую лунку микротитр, пластину.

3.10 мкл. отрицательного контроля в лунку А-1;

4. 10 мкл. положительного контроля в лунку В-1;

5. 10 мкл. положительного контроля в лунку С-1;

6.По 10 мкл. испытуемых образцов сыворотки в Д-1; и т.д. используя для каждого образца новый наконечник.

7.После внесения проб содержимое лунок тщательно перемешивают, микропанели помещают в пластиковый пакет Плотно закрыть пластину и инкубируют 1 час при 37С.

.

8.После инкубации лунки освобождают от содержимого резким встряхиванием.

9.Заливаем по 300 мкл промывочного раствора в каждую лунку и промываем 3 раза. Затем панель просушиваем постукиванием по сложенной в несколько слоёв фильтровальной бумаге.

10.Развести конъюгат: 1: 100 в буфере ( 10 мл. промывочного раствора - отнять 0,1 мл + 0,1 мл конъюгата).

11.Конъюгат залить по 100 мкл в каждую лунку.

12.Плотно накрыть пластину.

13.Инкубировать 30 мин.(±5 мин.) при t: +37° С ( ± 3° С) и выливаем.

14.Промываем 3 раза по 300мкл

15.После последней промывки, положить пластину на впитывающее полотенце, чтобы полностью освободить лунки от промывочного раствора!

16.Залить по 100 мкл. «ТМВ» (открывающий раствор -3) в каждую лунку.

Инкубировать 20 мин. При t 21⁰ С (± 5 ⁰ С ), закрыть от света ( хранить в темном месте).

17.Реакцию останавливают добавлением в каждую лунку по 100мкл. «Стоп - раствора»

18.Слегка взболтать пластину, пока цвет раствора не станет однородным. Тщательно вытереть нижнюю сторону пластины.

19.. Проводим измерение на спектофотометре и записываем результаты согласно показаниям прибора. Учет реакции в течение 1 часа, после « Стоп — раствора», при условии, что пластина хранится в темноте

Положительный контроль минимальная ОП около 0,350

20.Отношение между ОП полож. контроля при 450 нм. и отрицат. контроля при 450 нм. больше или =3.

С\П=(оп_{образца} – оп_{негат.контроля}\оп_{ср.позитив контроля}–оп_{негат.контроля})×100

ИНТЕРПРИТАЦИЯ

- пробы меньше 85% - отрицательные,

- пробы 85-115% - сомнительные.

- пробы больше 115% - положительные.

При получении положительного результата проводят подтверждение исследованием пробы в реакции ИФА по сыворотке крови (БЛОКИНГ), блокирует АТ характерные для лейкоза.

Дата добавления: 2014-06-19; просмотров: 556; Нарушение авторских прав

Мы поможем в написании ваших работ!