Технология приготовления бактериофагов

Технология приготовления бактериофагов, в основном, аналогична технологии приготовления вирусных препаратов, только вместо эукариотов используются бактериальные клетки, в которых бактериофаги размножаются.

Высокая специфичность некоторых штаммов бактериофагов позволяет использовать их для диагностики инфекционных заболеваний и индикации патогенных микроорганизмов. Фагоиндикация позволяет установить природу возбудителя инфекции даже в том случае, когда другие методы, в т.ч. и серологические, оказываются неэффективными.

В последние годы получение бактериофага широко используется как экспериментальная модель в молекулярной биологии, генной инженерии, биохимии и биофизике (рис.6).

Рис.6. Технология получения бактериофагов

Выявление фаговых частиц и определение их количества. Если к растущей в жидкой среде культуре чувствительных бактерий добавить небольшом количестве частицы вирулентного бактериофага, то бактериальные клетки окажутся зараженными. В течение некоторого времени никаких видимых изменений зараженных клеток обнаружить нельзя. Обычно этот период продолжается от 15 мин до 1ч, а иногда и более (длительность его зависит от природы фага и бактерии, а также от условий культивирования). Затем внезапно происходит лизис зараженных клеток.

При лизисе клетки из нее высвобождается большое количество новых фаговых частиц. Эти частицы могут в свою очередь заражать другие клетки популяции, и при этом вновь повторяется тот же самый процесс. Следовательно, если в культуру внести даже небольшое (по сравнению с количеством бактериальных клеток) число инфекционных фаговых частиц, то через несколько часов практически вся популяция бактерий будет уничтожена.

Число фаговых частиц или зараженных бактериальных клеток в суспензии легко определить, если подходящее разведение этой суспензии нанести на чашку с агаром, поверхность которого равномерно покрыта разбавленной суспензией чувствительных бактерий. После соответствующей инкубации вся поверхность чашки будет покрыта сплошным слоем бактерий, за исключением тех мест, где оказались частицы фага или зараженные клетки. В результате последовательных циклов развития фага пленка бактерий вокруг таких точек локально разрушается и образуются прозрачные зоны лизиса – бляшки

Если имеется смесь зараженных клеток и свободных фаговых частиц, то с помощью соответствующих методов их можно разделить (используя, например, дифференциальное центрифугирование) и затем с помощью описанного метода подсчета бляшек определить по отдельности число тех и других.

Если нужно определить лишь число фаговых частиц, содержащихся в суспензии, то можно избирательно убить присутствующие в ней зараженные клетки. Обычно для этого суспензию клеток и фага встряхивают с хлороформом, к которому бактериофаги устойчивы.

Выделение и очистка бактериофагов. Метод подсчета числа бляшек может быть использован для выделения тех фагов, которые способны развиваться в определенных видах или штаммах бактерий. Для этого пробу материала из природного местообитания такой бактерии встряхивают с водой, освобождают эту суспензию от бактерий, ее через мембранный фильтр или обрабатывая хлороформом, аликвоты смешивают с суспензией данной бактерии и высевают на чашки с агаром.

Любая бляшка, которая выявляется на чашках, соответствует присутствовавшей в природном материале фаговой частице. Фаг из отдельной бляшки можно выделить, прикоснувшись к ней стерильной иглой и суспендировав прилипший к игле материал в небольшом объеме стерильного раствора. Обычно в такой суспензии оказывается от 10⁴ до 10⁶ фаговых частиц. Затем проводят очистку фага, последовательно повторяя такое выделение из отдельной бляшки.

Для получения больших количеств фага для химического или физического исследования заражают фагом экспоненциально растущую в жидкой среде культуру бактерий. В результате ряда циклов развития фага большинство, а иногда и все клетки культуры, лизируются. Затем оставшиеся в культуре клетки и их обломки удаляют с помощью низкоскоростного центрифугирования, а получившуюся жидкость стерилизуют либо фильтрованием, либо обрабатывая ее хлороформом. В результате получается стерильный лизат, который содержит обычно от 10⁹ до 10¹² фаговых частиц на 1 мл, а также растворимый материал и фракцию частиц, которые освобождаются из клеток при лизисе.

Для окончательной очистки бактериофагов обычно используют ультрацентрифугирование. Даже самые мелкие фаговые частицы осаждаются при ускорениях порядка 100 000 g (в 10⁵ раз превышающих ускорение под действием земного притяжения). Часто предварительно вирусные частницы осаждают сульфатом аммония или некоторыми другими веществами.

Контроль фаговых препаратов проводят на чистоту, активность и специфичность.

Стерильность бактериофагов проверяют высевом на питательные и культивируют в термостатах при 37⁰С (для выявления бактериальной микрофлоры) и при 24 °С (для выявления грибковой флоры). Препарат считают годным, если через 8сут во всех средах не обнаруживают рост микроорганизмов. При выявлении роста бактерий или грибов хотя бы в одной пробирке проводят повторный контроль из удвоенного количества образцов. При повторном проросте сред препарат бракуют.

Активность и специфичность бактериофагов устанавливают на жидких и твердых питательных средах титрованием с соответствующим видом бактерий.

Если результаты проверки не соответствуют требованиям инструкций по изготовлению и контролю, то такой препарат не подлежит выпуску.

Дата добавления: 2014-03-03; просмотров: 2551; Нарушение авторских прав

Мы поможем в написании ваших работ!