КОНТРОЛЬ КАЧЕСТВА ОСАХАРИВАЮЩИХ МАТЕРИАЛОВ (4 ЧАСА)

Цель работы: Освоить контроль качесва осахаривающих ферментных препаратов, применяемых в спиртовой промышленности

Общие положения

Грибные и бактериальные ферментные препараты содержат богатый комплекс амилолитических ферментов, позволяющих полнее гидролизовать крахмал, чем при применении солода. Грибные культуры продуцируют a-амилазу, и глюкоамилазу, в них содержатся активные целлюлазы и гемицеллюлазы, протеолитические ферменты. Для осахаривания применяют глубинные культуры грибов и бактерий (Гх) и поверхностные культуры грибов (Пх), реже – высушенные препараты Г3х и очищенные Г10х.

2.1 Определение амилолитической активности колориметрическим методом

Аппаратура и реактивы: фильтровальная бумага, химичкеские стаканы на 30 мл, колба мерная на 100 мл, кварцевый песок, ацетатно-буферный раствор.

Порядок выполнения работы

а) Приготовление растворов из ферментных препаратов

Для приготовления основного раствора 0,1 г исследуемого препарата взвешивают в стаканчике вместимостью 25-30 мл.

1) Навеску тщательно растирают стеклянной палочкой с небольшим количеством воды, количественно переносят в мерную колбу вместимостью 100 мл, доводят дистиллированной водой до метки, перемешивают и фильтруют.

2) Для приготовления рабочего раствора ферментного препарата основной раствор разбавляют так, чтобы в 5 мл содержалось количество фермента, достаточное для гидролиза в принятых условиях 20-70% крахмала. Количество основного раствора препарата, которое необходимо взять для приготовления рабочего раствора фермента, находят по табл. 2.2.

б) Приготовление ферментного раствора из поверхностной культуры.

Для определения АС берут 5 г воздушно – сухой или 10 г влажной культуры, тщательно растирают с кварцевым песком или толченым стеклом в фарфоровой ступке и количественно переводят в стакан или коническую колбу, добавив 10 мл ацетатного буфера с рН 4,7 и 90 мл дистиллированной воды. Смесь выдерживают в течение 1 ч в термостате при 30 ⁰С, периодически перемешивая. Затем раствор отфильтровывают и фильтрат используют в качестве основного раствора для приготовления рабочего раствора фермента, как описано при определении ферментативной активности солода.

Ориентировочный расход основного раствора на приготовление рабочего раствора фермента нужной концентрации определяют по табл 2.

Таблица 2.2Данные для приготовления рабочего раствора фермента

в) Приготовление ферментного раствора из глубинной культуры.

Глубинную культуру фильтруют, фильтрат используют для приготовления рабочего раствора фермента. Для этого от 1 до 5 мл фильтрата (в зависимости от предполагаемой активности) разводят дистиллированной водой в мерной колбе вместимостью 100 мл.

Активность определяют по числу единиц, содержащихся в 1 г поверхностной культуры и в 1 мл глубиной.

Расчет ведут по уравнениям:

для поверхностной грибной культуры

АС = (7,264С – 0,03756)10³/а; (11)

для глубинной грибной культуры

АС = (7,264С – 0,03756)/V; (12)

для бактериальной культуры

АС = (5,885С+0,001671)10³/П, (13)

где 5,885; 0,001671; 7,264 и 0,03756 – постоянные коэффициенты, полученные экспериментально; а – масса поверхностей культуры в реакционной среде, мг; V – объем глубинной культуры, взятой на анализ, мл.; П – количество препарата, взятого на анализ, мг.

2.2 Определение глюкоамилазной активности (поляриметрический экспресс-метод)

Аппаратура и реактивы: пробирки с притертыми крышками, водяная баня, мальтоза, 5 Н раствор соляной кислоты.

Порядок выполнения работы

Метод основан на определении скорости гидролиза мальтозы глюкоамилазой. Скорость измеряется поляриметрическим способом.

Мальтоза не атакуется a - амилазой, поэтому глюкоза, образовавшаяся в процессе реакции, является единственным продуктом действия глюкоамилазы на мальтозу, а изменение величины угла вращения плоскости поляризации этого сахара в реакционной среде характеризует активность глюкоамилазы.

За единицу активности глюкоамилазы принимается такое количество фермента, которое катализирует гидролиз 1 мкмоля мальтозы при температуре 50±0,1 ⁰С и рН 4,7 в течение 1 мин.

Результаты определения активности фермента глюкоамилазы поляриметрическим методом можно также выражать в единицах стандартного глюкозооксидазного метода.

В этом случае за единицу активности глюкоамилазы принимается такое количество фермента, которое за 1 мин при температуре 30±0,1 ⁰С и рН 4,7 образует из крахмала 1 мкмоль глюкозы.

Культуральную жидкость фильтруют, добиваясь прозрачности, затем разбавляют водой: Глюкаваморин Гх-466 5-100 мл до 100 мл, Глюкоэндомикопсин Гх 5-10 мл до 50 мл., ультраконцентрат Глюкаваморина Г18х-466 5 мл до 250 – 500 мл.

Рабочий раствор поверхностной культуры готовят, как солодовую вытяжку.

Испытуемые растворы глюкоамилазы должны обеспечивать величину П от 0,5 до 2,0 ⁰ нормальной сахарной шкалы.

В две пробирки (для проведения параллельных определений) вводят по 25 мл 2%-ного раствора мальтозы и помещают их в водяную баню при 50±0,1⁰С на 10 мин для прогревания. Затем приливают по 5 мл ферментного раствора, энергично перемешивают и выдерживают точно 15 мин в водяной бане при 50±0,1 ⁰С, вынимают и добавляют 1 мл 5 н. раствора соляной кислоты, а затем 5 мл исследуемого раствора фермента.

Опытные и контрольный растворы охлаждают до комнатной температуры и определяют угол вращения плоскости поляризации, используя трубку длиной 200 мм на сахариметре. Если поляриметр с круговой шкалой, то

П⁰сах = П⁰круг. /0,3462 (14)

шкала шкала

Если исходный ферментный препарат был мутным, то гидролизаты следует осветлять, добавляя 1 мл 30%-ного раствора сульфата цинка и 1 мл 15%-ного раствора гексациано – (II) – ферроата калия.

В результате определений получают два значения угла вращения плоскости поляризации опытных проб (П₁ иП₂) и одно значение контрольной пробы Пк. Затем вычисляют разность (rП):

rП = Пк – (П₁+П₂)/2 (15)

rП должно быть в пределах от 0,5 до2⁰ нормальной сахарной шкалы, иначе определение следует повторить, приготовляя ферментную вытяжку с большим или меньшим количеством исходной культуральной жидкости.

Зная rП, определяют активность фермента глюкоамилазы (ГлС мп, в ед./мл или ед./г):

ГлС = 0,00243 х 31 х 10⁶ х rП/(t х 2 х 180, 16 а), (16)

где 0,00243 – коэффициент пересчета величины П в глюкозу, г на 1 мл инкубационной среды, мл; 10⁶ – коэффициент пересчета в микрограммы; t - продолжительность.

Вопросы для самоконтроля знаний:

1. Охарактеризуйте технологию и расчеты осахаривания ферментными препаратами.

2. Приведите принципы методов определения активности ферментных препаратов.

Лабораторная работа № 3

Дата добавления: 2014-11-08; просмотров: 524; Нарушение авторских прав

Мы поможем в написании ваших работ!